原創(chuàng) 飛飛 賽默飛色譜與質(zhì)譜中國
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李丕
食品組學(xué)
感官組學(xué)和風(fēng)味組學(xué)是食品組學(xué)的重要分支，旨在分析可能對食物的味道和氣味起關(guān)鍵作用的化合物，同時表征其生成途徑，指導(dǎo)優(yōu)化加工工藝，還可以通過某種食品的感官和風(fēng)味特征評價其真實(shí)性。感官和風(fēng)味組學(xué)的關(guān)鍵實(shí)施要素是將先進(jìn)的檢測技術(shù)與感官分析和嗅覺測量相結(jié)合，使用GC-MS結(jié)合化學(xué)計(jì)量方法對芳香化合物進(jìn)行非靶向分析和統(tǒng)計(jì)。
以下通過5個案例介紹賽默飛GC-MS家族在啤酒、羊肉、茶葉、精油風(fēng)味組學(xué)和橙汁真實(shí)性的應(yīng)用。
01
啤酒風(fēng)味 - ISQ
揮發(fā)性有機(jī)化合物 (VOC) 直接影響啤酒的風(fēng)味。它們與釀造原材料、酵母代謝、微生物污染和老化有關(guān)。因此將啤酒的化學(xué)組成與產(chǎn)品評估相結(jié)合以闡釋VOC 對啤酒香氣/接受度的影響非常重要。
巴西坎皮納斯大學(xué)化學(xué)研究所的Paiva使用全二維氣流調(diào)制器與ISQ7000聯(lián)用，搭建GC×GC-MS分析平臺對市場上的啤酒進(jìn)行風(fēng)味組學(xué)研究，研究成果發(fā)表在色譜A雜志[1]。
該工作根據(jù)Untappd® 平臺的啤酒平均等級得分（0-5分）選定樣品，共2組：第 1組平均評分低于 3 ，是消費(fèi)者偏好較低的啤酒；第 2組平均評分大于3，是公眾偏好度高的啤酒。風(fēng)味物質(zhì)的萃取富集通過TriPlus RSH自動進(jìn)樣器的HS-SPME組件完成（DVB/CAR/PDMS 萃取頭），隨后通過ISQ7000進(jìn)行非靶向分析。
圖 1-1. 使用HS-SPME-GC ×GC-MS 測試樣品的總離子流圖。( A ) 樣品 #1 – 第2組; ( B ) 樣品 #13 – 第 1 組；(C)方法空白。
通過NIST譜庫結(jié)合RI做峰定性鑒定，然后通過化學(xué)計(jì)量學(xué)手段對化合物做差異性分析。
在第 2 組啤酒樣品中發(fā)現(xiàn)29 種組分濃度高于第1組，主要是非氧化單萜和含氧萜烯。萜烯是啤酒花精油中最豐富的揮發(fā)性化合物，它們對麥芽汁表現(xiàn)出高親和力，可能會進(jìn)入啤酒對其風(fēng)味產(chǎn)生影響，因此是啤酒釀造商很感興趣的化合物。另外，發(fā)現(xiàn)2-乙基-1-己醇和 2-十一烷醇僅在第 2 組啤酒樣品中存在， 2-十一烷醇賦予啤酒新鮮和菝葜屬性。
最后，使用TriPlus RSH 、全二維氣流調(diào)制器與ISQ7000聯(lián)用，可以生成與香氣相關(guān)的指紋，并闡釋造成消費(fèi)者喜好差異的化合物分子，是研究消費(fèi)者對拉格啤酒偏好的有趣解決方案。
圖1-2. ISQ7610儀器圖片
02
羊肉風(fēng)味 – GC-Orbitrap 聯(lián)合 LC-Orbitrap
風(fēng)味和香氣感覺不僅來自揮發(fā)性化合物，而且還歸因于非揮發(fā)性物質(zhì)以及釋放揮發(fā)性化合物的基質(zhì)類型。中國農(nóng)科院北京畜牧獸醫(yī)研究所張軍民團(tuán)隊(duì)對高肌內(nèi)脂肪 (IMF)和低 IMF 胡羔羊進(jìn)行了脂質(zhì)組學(xué)和揮發(fā)性組學(xué)分析，旨在詳細(xì)說明具有不同 IMF 含量的個體的脂質(zhì)和香氣化合物譜的變化，并確定導(dǎo)致羊肉香氣譜差異的脂質(zhì)，研究成果發(fā)表在Food Chemistry 雜志[2]。
該研究通過LC-Orbitrap/MS詳細(xì)闡明具有不同 IMF 含量的羊肉的脂質(zhì)類別和脂質(zhì)分子譜，總共確認(rèn)了 842 種脂質(zhì)，其中79 種分子受到IMF含量影響而在各組之間存在差異；通過GC-Orbitrap/MS 在60,000 FWHM分辨率全掃描模式鑒定和半定量了羊肉中55種香氣化合物，其中15種化合物（主要來自脂質(zhì)氧化）對羊肉的整體香氣影響最大；最后使用偏最小二乘回歸 (PLS-R) 確定芳香化合物與脂質(zhì)之間的關(guān)系。
定性識別
其中芳香化合物的定性鑒定是通過與 NIST和 Wiley 譜庫、自動計(jì)算線性保留指數(shù)及差值、和風(fēng)味標(biāo)準(zhǔn)品比較得到的，半定量則通過使用內(nèi)標(biāo)（2-甲基-3-庚酮）進(jìn)行。
定量測定
值得一提的是，對于氣味活性值 (OAV) > 1 的芳香化合物，通過空白基質(zhì)匹配曲線來準(zhǔn)確定量，特征離子(m/z)通過標(biāo)準(zhǔn)品確定，標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍為 10 mg/L 至 2 g/L，R2 > 0.99。
一次進(jìn)樣，兼具非靶向和靶向分析
本工作中GC-Orbitrap/MS以全掃描模式采集數(shù)據(jù)，后處理時，既可以對全掃描譜圖通過非靶向篩查方法對未知物定性表征，也可以從全掃描譜圖中提取關(guān)鍵化合物特征離子通過靶向方法進(jìn)行定量，而無需二次進(jìn)樣。
表2-2. 15種關(guān)鍵芳香化合物的定量基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線（GC-Orbitrap/MS）（點(diǎn)擊查看大圖）
圖2-1. Orbitrap Exploris GC 240 儀器圖片
（分辨率高達(dá)240K）
03
橙汁真實(shí)性 – GC-Orbitrap
食品真實(shí)性是全世界都非常關(guān)注的領(lǐng)域。用濃縮（FC）橙汁代替非濃縮（NFC）橙汁是一種新的摻假問題。中國檢科院的陳穎教授團(tuán)隊(duì)使用HS-SPME-GC-Orbitrap/MS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)來區(qū)分NFC和 FC 橙汁，旨在研究 NFC 和 FC 橙汁之間的差異，探索橙汁加工過程中差異揮發(fā)性化合物形成的根本原因，研究成果表在 LWT 雜志[3]。
定性識別
化合物的識別鑒定通過NIST檢索評分 (RSI) 、及GC-Orbitrap獨(dú)有的高分辨率過濾 (HRF) 評分進(jìn)行，并通過TraceFinder軟件自動計(jì)算線性保留指數(shù)及差值輔助定性。共鑒定出71種揮發(fā)性化合物。
差異分析
共分析了 126 個果汁樣品中的 71 種揮發(fā)性化合物，通過內(nèi)標(biāo)法半定量篩選出 25 種差異性組分，由6種醇、8種萜烯、9種酯和2種酮組成，可用于區(qū)分 NFC 橙汁和 FC 橙汁。
關(guān)鍵組分與加工工藝探討
結(jié)合果汁加工階段探討了25種關(guān)鍵化合物的具體變化，結(jié)果表明濃縮處理是導(dǎo)致 NFC 和 FC 橙汁揮發(fā)性成分差異的關(guān)鍵加工步驟，濃縮處理后，FC橙汁中這些化合物的濃度顯著降低；熱滅菌導(dǎo)致的變化程度遠(yuǎn)小于濃縮。
真實(shí)性評價
基于 25 種差異化合物構(gòu)建 PLS-DA 模型并用于商業(yè)橙汁鑒定。分析了29種商品橙汁（14種NFC和15種FC），結(jié)果顯示所有的商品NFC樣本都與標(biāo)簽一致；而15個商品FC樣本中有2個被錯誤的檢測為NFC，這是因?yàn)檫@2個誤判的樣本中添加了橙漿，橙漿與橙汁中揮發(fā)性組分的濃度呈正相關(guān)。該項(xiàng)研究證明，使用 HS-SPME-GC-MS 結(jié)合化學(xué)計(jì)量分析在NFC 和 FC 橙汁鑒別方面具有巨大潛力。
圖3-1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（點(diǎn)擊查看大圖）
表3-1. 25種關(guān)鍵化合物在不同加工工藝的含量差異
（點(diǎn)擊查看大圖）
04
茶葉香氣 – GC-Orbitrap 結(jié)合
Compound Discoverer
我們采用Orbitrap Exploris GC結(jié)合HS-SPME Arrow分析多個不發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶和發(fā)酵茶樣品，通過Compound Discoverer組學(xué)分析軟件的非靶向workflow自動進(jìn)行解卷積和定性分析，包括EI和PCI聯(lián)合預(yù)測驗(yàn)證，得到最準(zhǔn)確的分析結(jié)果，該方法可廣泛用于非靶向風(fēng)味組學(xué)的研究中。
圖4-1. Compound Discoverer 組學(xué)分析軟件中的全自動EI Workflow（點(diǎn)擊查看大圖）
圖4-2. Compound Discoverer 組學(xué)分析軟件中的全自動的PCI Workflow（點(diǎn)擊查看大圖）
差異香氣化合物
與其他品種茶葉樣品比較，正山小種的香氣特征為鐮葉芹醇、可卡醛等；福鼎白茶為 α-柏木烯，植酮等。
圖4-3. CD軟件自動繪制的不同茶葉PCA圖
（點(diǎn)擊查看大圖）
圖4-4. CD軟件自動繪制的火山圖（點(diǎn)擊查看大圖）
定性確證
以RT=27.843min的化合物為例，EI workflow解卷積定性為2-乙酰基吡咯（食用香精，可用于茶葉），總得分97，HRF得分99.4，相似度指數(shù)（SI）861。接著用PCI workflow進(jìn)一步驗(yàn)證，軟件可根據(jù)反應(yīng)氣類型自動尋找分子離子M+= 109.05269，并在Predict Compositions節(jié)點(diǎn)自動預(yù)測可能的化學(xué)式為C6H7NO，并預(yù)測同位素離子豐度與實(shí)測質(zhì)譜圖比對。最后利用ChemSpider節(jié)點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)式檢索，得到的匹配結(jié)果信息為2-乙?；量@與EI定性結(jié)果一致。
圖4-5. EI解卷積后的NIST匹配結(jié)果（質(zhì)量偏差-0.49ppm, -0.00005Da）（點(diǎn)擊查看大圖）
圖4-6. PCI解卷積結(jié)果，自動找到分子離子M+= 109.05269（點(diǎn)擊查看大圖）
圖4-7. PCI自動預(yù)測分子式，C6H7NO
（點(diǎn)擊查看大圖）
圖4-8. ChemSpider節(jié)點(diǎn)確認(rèn)的化合物（質(zhì)量偏差-0.67ppm，-0.00007Da），與EI匹配結(jié)果一致（點(diǎn)擊查看大圖）
EI/CI自由切換，拒絕宕機(jī)
EI結(jié)合PCI雙重定性需要切換EI和CI離子源。賽默飛具有獨(dú)特的VPI技術(shù)，可以在不破壞質(zhì)譜真空的情況下2分鐘之內(nèi)切換EI源和CI源，5分鐘內(nèi)更換色譜柱，消除宕機(jī)時間，輕松實(shí)現(xiàn)EI/PCI聯(lián)合定性或雙柱RI定性。
05
植物精油 – GC×GC-Orbitrap
精油具有香氣和抗菌性，因此作為天然調(diào)味劑和抗菌劑用于食品。收獲季節(jié)、地理來源、萃取方式都會影響精油組成，造成其感官特征和抗菌性能的差異。有必要對精油中痕量化合物進(jìn)行表征和差異分析。
我們搭建了GC-Orbitrap/MS與全二維固態(tài)調(diào)制器聯(lián)用平臺，通過全自動的非靶向分析流程，對共流出化合物進(jìn)行有效分離定性，為未知物的分離鑒定提供新的思路和方法。
GC×GC全二維分離
在二維TIC圖中，可以看到多個一維保留時間完全一致的組分簇（如：RT 43.903min，RT=50.203min）。本實(shí)驗(yàn)中使用全二維氣相色譜通過串聯(lián)兩根不同極性的色譜柱，在第二個維度上實(shí)現(xiàn)了一維共流出化合物的分離，一針進(jìn)樣實(shí)現(xiàn)雙柱分離的效果，很大程度上簡化了從復(fù)雜樣品中鑒定未知化合物的流程（圖5-1）。
圖5-1. 通過二維色譜分離，一維色譜柱上完全共流出的化合物被準(zhǔn)確定性（點(diǎn)擊查看大圖）
圖5-2. 精油樣品全二維GC×GC-Orbitrap/MS分析結(jié)果（3D視圖）（點(diǎn)擊查看大圖）
寬動態(tài)范圍內(nèi)準(zhǔn)確定性
高分辨質(zhì)譜在未知化合物分析中最大的優(yōu)勢之一，在于可以通過化合物實(shí)測的精確質(zhì)量數(shù)對化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行推斷。在TIC圖中選取主要成分乙酸冰片酯和痕量組分丁香酚（比主成分低4個數(shù)量級），查看二者的精確質(zhì)量數(shù)測量結(jié)果（圖5-3和5-4）。結(jié)果顯示，二者的實(shí)測離子和同位素離子的質(zhì)量偏差均小于2ppm。
圖5-3. 精油樣品TIC圖：①主要成分，RT=36.43，乙酸冰片酯；②痕量組分，RT=39.53，丁香酚。（點(diǎn)擊查看大圖）
圖5-4. GC×GC-Orbitrap/MS實(shí)測主成分和痕量組分的質(zhì)量精度（<2ppm）及位素離子豐度比率（通過）（點(diǎn)擊查看大圖）
綜上，GC×GC-Orbitap/MS在精油樣品定性分析中表現(xiàn)優(yōu)異，通過全自動的解卷積非靶向分析流程，無論主成分還是痕量成分都可以準(zhǔn)確定性；全二維色譜提升了色譜分離能力，可得到更全面的樣品成分剖析信息。
圖5-5. Orbitrap Exploris GC 240 儀器圖片
（分辨率高達(dá)240K）
小 結(jié)
食品組學(xué)分析通常使用先進(jìn)的數(shù)據(jù)分析方法，適當(dāng)?shù)姆治鰞x器也是重要因素。如今食品組學(xué)離不開質(zhì)譜法，對于揮發(fā)性或半揮發(fā)性的化合物，使用是氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）法。賽默飛提供全線氣相色譜質(zhì)譜產(chǎn)品，包含氣相色譜、四極桿質(zhì)譜及高分辨靜電場軌道阱質(zhì)譜，并配套定量、定性、組學(xué)分析軟件，提供完善可靠的分析流程。
（點(diǎn)擊查看大圖）
參考文獻(xiàn)：
[1].https://doi.org/10.1016/j.chroma.2020.461529
[2].https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.132611
[3].https://doi.org/10.1016/j.lwt.2022.113504
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