目錄:北京蘭博利德商貿(mào)有限公司>>分子生物學(xué)試劑>>克隆相關(guān)>> D0204P-25rxnsDNA Assembly Mix Plus
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 貨號 | D0204P |
|---|
DNA Assembly Mix PLUS KIT
產(chǎn)品貨號：D0204P
儲存條件：-20℃
產(chǎn)品組分
組分/規(guī)格 | 10T | 25T | 50T |
DNA Assembly Mix PLUS | 50μl | 125μl | 250μl |
pUC19 Control Plasmid, Linearized (Ampr, 40 ng/μl) | 5μl | 5μl | 5μl |
500 bp Control Fragment (20 ng/μl) | 5μl | 5μl | 5μl |
產(chǎn)品簡介
基于重組原理的無縫克隆技術(shù)，作為新一代的克隆方法，不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補(bǔ)平等操作，依據(jù)DNA片段與線性化載體末端的15~25nt同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點(diǎn)，載體自連背景極低，是一種簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術(shù)。
DNA Assembly MixPLUS無縫克隆試劑盒最快僅需5分鐘即可完成單片段重組，且陽性率高于95%。Mix中添加的輔助因子，有效提高克隆陽性率；經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系，能夠一定程度上耐受未純化PCR產(chǎn)物中含有的雜質(zhì)。升級版的無縫克隆試劑盒具有更高的陽性率、更好的兼容性。
使用簡單 —— 兼容PCR與酶切體系，省去繁瑣的純化步驟
超高效率 —— 可以穩(wěn)定支持5-6片段在同一克隆體系
穩(wěn)定可靠 —— 37℃放置一周或凍融30次，無明顯下降
實(shí)驗(yàn)步驟
1、實(shí)驗(yàn)流程概要
2、線性化克隆載體制備
選擇合適的克隆位點(diǎn)，對載體進(jìn)行線性化，載體的線性化可以通過酶切或反向 PCR 擴(kuò)增完成。
① 酶切制備
推薦使用LabFD™快速內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，使載體線性化wan 全，以降低轉(zhuǎn)化背景(假陽性克隆)；若使用單酶切進(jìn)行線性化，可以適當(dāng)延長酶切時(shí)間以減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。
注1：經(jīng)雙酶切進(jìn)行線性化的載體無需去磷酸化，經(jīng)單酶切則需要去磷酸化；
注2：酶切完成后，應(yīng)將快速內(nèi)切酶失活或?qū)δ康漠a(chǎn)物純化后再用于重組反應(yīng)。
② 反向 PCR 擴(kuò)增制備
為減少擴(kuò)增突變的引入，推薦使用高保真PCR Mix進(jìn)行擴(kuò)增。推薦使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為模板，以減少環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留對克隆陽性率的影響。
3、插入片段PCR引物設(shè)計(jì)
PCR引物的5' 端必須包含與其相鄰片段（插入片段或載體）末端同源的15~25 nt（推薦18nt）序列。假如載體為粘性末端，且3'端突出，則引物設(shè)計(jì)必須包含突出部分；若5'端突出，則引物設(shè)計(jì)可以包含突出部分，也可以不包含。
插入片段正向擴(kuò)增引物：
5'—上游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)（可選）+ 基因特異性正向擴(kuò)增序列— 3'
插入片段反向擴(kuò)增引物：
3'—基因特異性反向擴(kuò)增序列+酶切位點(diǎn)（可選）+下游載體末端同源序列—5'
注1：盡量選擇無重復(fù)序列且GC含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆，當(dāng)載體克隆位點(diǎn)上下游25 nt區(qū)域內(nèi)GC含量為40%~60%時(shí)，重組效率zui高；
注2：本試劑盒所提供的 pUC 19 載體（Ampr）連接端序列如下：
4、插入片段的 PCR 擴(kuò)增
推薦使用高保真PCR Mix進(jìn)行擴(kuò)增，以減少擴(kuò)增突變的引入。建議使用純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行無縫克隆反應(yīng)，若PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，可直接使用，但加樣體積不應(yīng)超過總反應(yīng)體積的20%。
5、重組反應(yīng)
①于冰水浴中配置以下反應(yīng)體系：
組分 | 反應(yīng)體系 | 陰性對照 | 陽性對照（如有必要） |
DNA Assembly Mix | 5μl | 5μl | 5μl |
線性化載體（ng） | 50~200ng | 50~100ng | pUC19 Control Plasmid,Linearized, 1 μl |
插入片段 | 10~200 ng | - | 500 bp Control, Fragment, 1 μl |
ddH2O | To 10 μl | ||
a.最適載體用量(ng)=0.02×載體堿基對數(shù)，即0.03pmol。
b.插入單片段，最適片段用量（ng）= 0.04×片段堿基對數(shù)；
插入多片段，每片段zui適用量（ng）= 0.02×片段堿基對數(shù)。
注1：若插入單片段的長度大于載體，則應(yīng)互換載體與插入片段用量；
注2：若插入片段的長度小于200 bp，則插入片段應(yīng)使用5倍載體用量；
注3：若按上述公式計(jì)算得到的用量超過zui低/zui高值，則建議直接按zui低/最高用量使用；
注4：載體片段過長、插入片段過長克隆陽性率均會降低。
重組反應(yīng)體系配制完成后，用移液槍輕輕吸打混勻各組分，避免產(chǎn)生氣泡，切勿渦旋。
② 將反應(yīng)體系置于50℃，反應(yīng)5~60min。
注1：推薦使用 PCR 儀等溫控比較精準(zhǔn)的儀器進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間不足或太長克隆效率均會降低；
注2：插入1-2個(gè)片段時(shí)，推薦反應(yīng)時(shí)間5-15min，插入3-5個(gè)片段時(shí)，推薦反應(yīng)時(shí)間15-30min；
注3：當(dāng)載體骨架在 10 kb 以上或插入片段在4 kb以上時(shí)，建議延長反應(yīng)時(shí)間到30-60min
注4：50℃反應(yīng)完成后，建議進(jìn)行瞬時(shí)離心，將反應(yīng)液收集至管底。
③ 將反應(yīng)液離心管置于冰上冷卻，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化或者儲存于-20℃。
注1：-20℃儲存的重組產(chǎn)物，建議在1周內(nèi)使用。
6、重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
取5~10μl反應(yīng)液，加入到100 μl感受態(tài)細(xì)胞中緩慢吸打混勻，冰上放置30min。42℃熱激45~60sec，冰浴5 min。加500 μl SOC或LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)40~60min（200 rpm）。將菌液均勻涂布在含有對應(yīng)抗生素的平板上，倒置于37℃過夜培養(yǎng)。
注1：不同感受態(tài)細(xì)胞最后的克隆陽性率會有所差別，推薦使用轉(zhuǎn)化效率>108 CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞；
注2：菌落數(shù)取決于PCR產(chǎn)物與線性化載體的數(shù)量和純度；
注3：陽性對照平板通常生長大量白色單菌落，陰性對照平板只生長很少的菌落。
7、陽性克隆檢測
挑取單菌落至10 μl ddH2O中混勻，95℃裂解10 min 后，取1 μl裂解液作為模板，進(jìn)行菌落PCR鑒定，或?qū)尉浣臃N至抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。
注1：菌落 PCR 時(shí)建議至少使用一條通用引物，避免假陽性結(jié)果；
注2：必要時(shí)可進(jìn)一步對陽性結(jié)果進(jìn)行測序鑒定。
常見問題
問題描述 | 原因 | 解決方法 |
轉(zhuǎn)化效率低 | 感受態(tài)效率低下 | 使用新制備或妥善保存的感受態(tài)細(xì)胞。 |
DNA片段比例不佳 | 按照說明書推薦的zui適用量和比例配制反應(yīng)體系。載體和插入片段的濃度測定： 若線性化載體與插入片段已經(jīng)過純化，且經(jīng)電泳檢測條帶單一或無Smear殘留時(shí)，可使用超微量核酸蛋白檢測儀等基于分光光度法的儀器進(jìn)行濃度測定，但只有當(dāng)A260/A280 在1.8~2.0之間時(shí)濃度值可信；若線性化載體與插入片段未經(jīng)過純化，也可使用瓊脂糖電泳測定樣品濃度。 | |
DNA片段純度不夠 | 對載體和插入片段進(jìn)行膠回收純化。由于EDTA等金屬離子螯合劑會抑制無縫克隆反應(yīng)，因此純化產(chǎn)物應(yīng)溶解于ddH2O中，切勿使用Tris-EDTA等緩沖液。 | |
反應(yīng)產(chǎn)物過量 | 在轉(zhuǎn)化體系中，無縫克隆反應(yīng)產(chǎn)物體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的10%。 | |
大量克隆不含插入片段 | 載體線性化不wan全 | 酶切制備線性化載體時(shí)，提高快速內(nèi)切酶的使用量，延長反應(yīng)時(shí)間，使用膠回收純化酶切產(chǎn)物。 |
相同抗性質(zhì)粒污染 | 以質(zhì)粒為模板進(jìn)行插入片段 PCR 擴(kuò)增時(shí)，使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為擴(kuò)增模板，使用DpnI 等甲基化敏感型內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理，或?qū)Ξa(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。 | |
平板抗性不足 | 確保使用正確的抗生素，并使用新鮮制備的抗生素平板。 | |
大量克隆含有 不正確插入片段 | 非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 | 優(yōu)PCR體系，提高擴(kuò)增特異性，或膠回收純化PCR產(chǎn)物重疊序列的擴(kuò)增引物。 |
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