ELISA運(yùn)用了免疫學(xué)原理和化學(xué)反應(yīng)顯色原理，需要將抗原或抗體預(yù)包被在固相載體表面，使后來(lái)形成的抗原-抗體-酶（熒光基團(tuán)）-底物復(fù)合物黏附在載體上，通過(guò)檢測(cè)OD值或發(fā)光值，來(lái)檢測(cè)靶蛋白的含量。ELISA適合用于定量檢測(cè)胞外的分泌性蛋白，檢測(cè)大分子抗原和特異性抗體等。那么ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果異常的因素有哪些呢？讓我們一起來(lái)看看吧！
一、樣品
樣品是檢測(cè)的前提，樣品質(zhì)量會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？梢杂肊LISA來(lái)檢測(cè)的樣品很多，根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目不同可以是血清、血漿、唾液、尿液等，但大部分還是以血清為樣品。作為血清樣品，應(yīng)避免溶血，溶血可能會(huì)增加非特異性顯色，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)誤差。
血清樣品的反復(fù)凍融會(huì)使血清中的抗體效價(jià)下降，所以需要多次檢測(cè)的血清樣品，如在5d內(nèi)檢測(cè)完，可4℃保存，如需長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)，可進(jìn)行分裝凍存。樣品如被細(xì)菌污染腐敗，可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性。
二、溫度
溫度主要影響抗原抗體反應(yīng)，酶促反應(yīng)速度及非特異性吸附，溫度升高可使抗原抗體結(jié)合反應(yīng)加速，但也易引起抗原抗體復(fù)合物的解離。酶促反應(yīng)速度同樣隨溫度升高而增快，但是酶蛋白變性也加快，喪失酶學(xué)活性，降低酶的有效濃度而減慢反應(yīng)速度，溫度低時(shí)以前者為主，高時(shí)以后者為主。
溫度是質(zhì)量控制的一個(gè)重要方面，一般允許±1℃的誤差。最好水浴，微孔板浮在水面，使溫度迅速平衡。如放溫箱內(nèi)溫育，微孔板不應(yīng)疊置，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，盛放微孔板的濕盒應(yīng)是金屬的，傳熱容易?？諠窈袘?yīng)預(yù)先放在溫箱中，以平衡溫度，在室溫較低時(shí)更需要。
三、時(shí)間
在溫度保證的前提下，時(shí)間的控制至關(guān)重要，尤其是底物顯色的時(shí)間控制，顯色時(shí)間不足或過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)不成立，無(wú)法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷。
加人標(biāo)本、試劑及混合的時(shí)間稱為操作時(shí)差。操作時(shí)差在每個(gè)試驗(yàn)中都存在，對(duì)結(jié)果或多或少有影響。對(duì)手工操作，尤其是樣品量大的項(xiàng)目，從加人第一個(gè)標(biāo)本到最后一個(gè)標(biāo)本，需幾十分鐘，加人試劑及混勻存在很大的時(shí)間差異，使抗原抗體和酶促反應(yīng)時(shí)間不一致，易產(chǎn)生假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果。
因此，樣品過(guò)多時(shí)，請(qǐng)選擇分批操作，對(duì)勿須更換移液口吸嘴的酶結(jié)合物，底物的加樣可選擇8聯(lián)或12聯(lián)專(zhuān)用的多道加液器。亦可避免單孔滴加底物時(shí)遺漏多加。
四、設(shè)備
儀器設(shè)備是ELISA實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，常用的相關(guān)儀器設(shè)備包括移液器、酶標(biāo)儀、洗板機(jī)和恒溫箱等。所有設(shè)備都需要進(jìn)行檢驗(yàn)校準(zhǔn)，保證準(zhǔn)確性和精確度。
移液器的使用要盡可能選擇所需加液量接近最大量程，并正確使用，減少實(shí)驗(yàn)誤差。
酶標(biāo)儀要提前開(kāi)機(jī)預(yù)熱，保證光源穩(wěn)定；洗板機(jī)要檢查加液孔是否通暢，保證加液量。
恒溫箱要提前開(kāi)機(jī)，開(kāi)、關(guān)門(mén)要快速，保證反應(yīng)溫度。
五、顯色
顯色是ELISA中的最后一步反應(yīng),此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi),陰性孔可保持無(wú)色,而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。
在定量測(cè)定中,加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測(cè)定的顯色可在室溫進(jìn)行,時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制,有時(shí)可根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延。
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