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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | YLK10407P | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
| 主要用途 | 科研實驗 | 保存條件 | 低溫運輸，-20℃保存 |
| 有效期 | 12個月 | 試劑盒說明 | 不同批號的試劑盒組分不可交互使用 |
水稻內(nèi)源基因SPS核酸檢測試劑盒
產(chǎn)品名稱：水稻內(nèi)源基因SPS核酸檢測試劑盒
英文名稱：Diagnostic Kit for SPS Gene DNA（Real-Time PCR Method）
本試劑盒適用于檢測轉(zhuǎn)基因植物的SPS基因，用于篩查待檢測植物中是否含有SPS成分。其檢測結(jié)果僅供參考。
本試劑盒用國家標準的SPS特異性引物和探針，用熒光PCR 技術(shù)進行轉(zhuǎn)基因成分的檢測。
【試劑組成】
名 稱 | 規(guī) 格 |
酶液 | 50μL×1管 |
SPS反應(yīng)液 | 1.0mL×1管 |
SPS陽性質(zhì)控品 | 50μL ×1管 |
陰性質(zhì)控品 | 250μL ×1管 |
【運輸及保存】
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【標本采集】
稱取200g樣品。
【保存和運輸】
上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標本運送應(yīng)采用0℃冰壺。
【注意事項】
1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1 樣本前處理
固體樣本：用粉碎機或冷凍研磨儀將樣品研磨至細粉狀。
1.2 DNA提取
對于固體標本，DNA的提取可以采用SN/T 2584-2010中推薦的方法：
1) 每個樣品取2個平行管。稱取200mg粉碎的樣品，加入1mL預冷至4℃的抽提液，劇烈搖動混勻后，在冰上靜止5min，4℃條件下10000g離心15min，棄上清液；
2) 加入600uL預熱至65℃的裂解液，充分重懸沉淀，在65℃恒溫保持40min，期間顛倒混勻5次；
3) 室溫條件下10000g離心10min，取上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入5uLRNAseA，37℃恒溫30min，分別用等體積苯/酚：異戊醇溶液和三氯jia烷：異戊醇溶液各抽提一次；
4) 室溫條件下，10000g離心10min，取上清液至新離心管，加入三分之二體積的異丙醇，十分之一體積的3mol/L的乙酸鈉溶液（pH=6.5），-20℃放置2-3h；
5) 在4℃條件下，10000g離心15min，棄上清液，用70%乙醇洗滌沉淀一次，倒出乙醇，晾干沉淀；
6) 加入50uL TE（pH8.0）溶解沉淀，所得溶解即為樣品DNA溶液。
也可使用等效的DNA/提取試劑盒。
油脂樣本請直接選用市售油脂DNA/提取試劑盒，按說明操作。
2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 | SPS反應(yīng)液 | 酶液 |
用量 | 20μL | 1μL |
3. 加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟1提取的DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μL，加入相應(yīng)的
反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為25ul；熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。
5.2 結(jié)果判斷
陽性：檢測通道Ct值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；
可疑：檢測通道35<Ct值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為35<Ct值≤38，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；
陰性：樣本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。
6. 檢測方法的局限性
樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；
陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；
病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；
不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；
試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；
本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7. 質(zhì)控標準
陰性質(zhì)控品：Ct>38或無Ct值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤32；
以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，wan全混勻并短暫離心；
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；
7.實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
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