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更新時(shí)間：2024-07-18 12:35:35瀏覽次數(shù)：553評(píng)價(jià)
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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50T |
|---|---|---|---|
| 貨號(hào) | YLK10403P | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
| 主要用途 | 科研實(shí)驗(yàn) | 保存條件 | 低溫運(yùn)輸，-20℃保存 |
| 有效期 | 9個(gè)月 | 試劑盒說(shuō)明 | 不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用 |
手足口EV71/CA16/EV三通道核酸檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品名稱(chēng)：手足口EV71/CA16/EV三通道核酸檢測(cè)試劑盒
英文名稱(chēng)：Detection Kit for Enterovirus 71/Coxsackievirus A16/Enterovirus RNA (PCR-Fluorescence Probing)
手足口病 ( hand, foot and mouth disease,HFMD)在近年兒童中常見(jiàn)流行 ,由腸道病毒感染引起 ,主要表現(xiàn)口腔黏膜潰瘍性皰疹及四肢末端水皰樣皮疹 ,主要病原為柯薩奇病毒 A16 型(CA16)和腸道病毒 71 型(EV71),二者所致的手足口病臨床難以區(qū)別。其中,EV71 不僅引起手足口病 ,而且可引起嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥 ,如腦膜炎、腦炎、急性遲緩性癱瘓等。實(shí)現(xiàn)對(duì)腸道病毒的快速檢測(cè)有利于疫情監(jiān)測(cè)以及制定有效的預(yù)防控制措施。本試劑盒適用于糞便、咽/拭子、肛拭子樣本中腸道病毒的檢測(cè)，并可區(qū)分是否為腸道病毒 71 型或柯薩奇病毒A16 型。檢測(cè)結(jié)果僅供研究，不用于臨床診斷。
【試劑組成】
組分名稱(chēng) | 規(guī)格 | 數(shù)量 | 主要成分 | |
PCR 檢測(cè)試劑 （50 反應(yīng)/盒） | EV71/CA16/EV PCR 反應(yīng)液A | 816µl/管 | 1 | 特異性引物、探針、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液等 |
EV71/CA16/EV PCR 反應(yīng)液B | 144µl/管 | 1 | 熱啟動(dòng)Taq 酶、c-MMLV 酶等 | |
質(zhì)控品 | 陰性質(zhì)控品 | 400µl/管 | 1 | 生理鹽水 |
EV71/CA16/EV 陽(yáng)性質(zhì)控品 | 400µl/管 | 1 | 含目的片段的重組質(zhì)粒 | |
【運(yùn)輸及保存】
試劑盒保存于-20±5℃，有效期 9 個(gè)月。
試劑盒在 37℃可保存72 h；試劑在 4℃可保存7 天；避免反復(fù)凍融，反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 7 次；試劑開(kāi)瓶次數(shù)不超過(guò) 7 次。運(yùn)輸采用干冰保持低溫，運(yùn)輸時(shí)間不應(yīng)超過(guò) 3 天。試劑盒生產(chǎn)日期見(jiàn)產(chǎn)品標(biāo)簽。
【適用儀器】ABI 7500、LightCycler480 等多通道熒光定量PCR 儀。
【注意事項(xiàng)】
1.樣本處理和核酸提取（樣本處理區(qū)）
建議取 200μl 液態(tài)樣本進(jìn)行核酸提取?？刹捎帽竟旧a(chǎn)的核酸提取/試劑盒，請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；也可選擇其他合適的商業(yè)化產(chǎn)品。
本試劑盒中的陰性質(zhì)控品參與提取，用于對(duì)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控；EV71/CA16/EV 陽(yáng)性質(zhì)控品不參與提取，用于PCR 檢測(cè)試劑的質(zhì)控。2.PCR 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
從試劑盒中取出EV71/CA16/EV PCR 反應(yīng)液A、EV71/CA16/EV PCR 反應(yīng)液B，室溫融化后振蕩混勻，8,000rpm 離心數(shù)秒后使用。
2.1 EV71/CA16/EV 反應(yīng)體系配制
取適量PCR 反應(yīng)管，每管加入EV71/CA16/EV PCR 反應(yīng)液A 17µl、EV71/CA16/EV PCR 反應(yīng)液B 3µl（也可根據(jù)PCR 反應(yīng)用量，計(jì)算各組分所需總量，混勻后分裝 20µl 于單個(gè)PCR 反應(yīng)管中）；
3. 加樣（樣本制備區(qū)）
于上述PCR 反應(yīng)管中分別加入處理后的陰性質(zhì)控品、待測(cè)標(biāo)本核酸、EV71/CA16/EV 陽(yáng)性質(zhì)控品各5µl，蓋緊管蓋，8,000rpm 離心數(shù)秒后轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)。
3.1 ABI Prism 7500 儀器設(shè)置（ABI 7500 儀器操作為例，ABI 7300 儀器參照此操作及儀器操作手冊(cè)）
3.1.1 打開(kāi)“Setup"窗口，按樣本對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控（NTC）、陽(yáng)性質(zhì)控以及未知樣本（Unknown），并在“Sample Name"一欄中設(shè)置樣本名稱(chēng)；探針檢測(cè)模式設(shè)置為：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none；Reporter Dye2：VIC ，Quencher Dye2：none； Reporter
Dye3：Texas Red，Quencher Dye3：none；Passive Reference：NONE.
3.1.1 打開(kāi)instrument 窗口，設(shè)置循環(huán)條件如下： 50℃ 15 分鐘，1 個(gè)循環(huán)；
95℃ 15 分鐘，1 個(gè)循環(huán)；
94℃ 15 秒→55℃ 45 秒（收集熒光），40 個(gè)循環(huán)。設(shè)置完成后，保存文件，運(yùn)行程序。
3.2 LightCycler480 儀器設(shè)置
3.2.1 點(diǎn)擊軟件主界面的“New Experiment",進(jìn)入程序設(shè)定界面。
3.2.2 檢測(cè)模式設(shè)置：從Detection Format 的下拉框中選擇分析模式：Multi Color Hydrolysis Probe,“Customizes"模塊中選擇483-533、 523-568、 558-610 濾片組合，“Block Type"為儀器自動(dòng)檢測(cè)， “Plate ID"可手工輸入或掃描儀掃描，“Reaction Volume"設(shè)定為 25ul。
3.2.3 循環(huán)參數(shù)：定義PCR 程序中每個(gè)步驟（Program Name）及循環(huán)數(shù)(Cycles)和分析模式(Analysis Mode),利用“+"和“-"增加或刪除步驟，擴(kuò)增參數(shù)如下：
50℃ 15 分鐘，1 個(gè)循環(huán)；
95℃ 15 分鐘，1 個(gè)循環(huán)；
94℃ 15 秒 55℃ 45 秒，40 個(gè)循環(huán)；（此步采集熒光信號(hào)：“Analysis Mode"選擇“Quantification",“Acquisition Mode"選擇 “Single"）
40℃ 10 秒，1 個(gè)循環(huán)；
3.2.4 填樣品表：點(diǎn)擊“Sample Editor"模塊，進(jìn)入樣本信息編輯界面，在“Select Workflow"中選擇“Abs Quant",在“Sample Name" 列中定義樣本名稱(chēng),在“Sample Type"欄中選定樣品類(lèi)型：陰性質(zhì)控品選NTC；未知樣品選Unknown。
3.2.5 運(yùn)行程序：點(diǎn)擊“Experiment"模塊，回到程序設(shè)定界面，點(diǎn)擊窗口右下方的“Start Run",彈出結(jié)果保存窗口，輸入文件名和路徑后進(jìn)入程序運(yùn)行界面。
4. 結(jié)果分析
4.1 反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。
4.2 分析條件設(shè)置：根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline 的start 值、stop 值以及Threshold 的Value 值（用戶(hù)可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整， Start 值可以在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20，調(diào)整陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線(xiàn)平直或低于閾值線(xiàn)），點(diǎn)擊 Analysis 自動(dòng)獲得分析結(jié)果，在 Report界面察看結(jié)果。
【質(zhì)量控制】
陰性質(zhì)控品：FAM、VIC、Texas Red 檢測(cè)通路無(wú)明顯擴(kuò)增曲線(xiàn)；
陽(yáng)性質(zhì)控品：FAM、VIC、Texas Red 檢測(cè)通路均有明顯擴(kuò)增曲線(xiàn)，且 Ct 值≤32； 以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿(mǎn)足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重新進(jìn)行。
【結(jié)果判斷】
1. 若檢測(cè)樣品的擴(kuò)增曲線(xiàn)在FAM、VIC、Texas Red 檢測(cè)通路均無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)或Ct 值＞38，可判樣品為EV71、CA16、腸道病毒陰性；
2. 若檢測(cè)樣品的擴(kuò)增曲線(xiàn)在FAM 檢測(cè)通道有擴(kuò)增曲線(xiàn)且Ct 值≤38，可判樣品為EV71 陽(yáng)性；
3. 若檢測(cè)樣品的擴(kuò)增曲線(xiàn)在VIC 檢測(cè)通道有擴(kuò)增曲線(xiàn)且Ct 值≤38，可判樣品為CA16 陽(yáng)性；
4. 若檢測(cè)樣品的擴(kuò)增曲線(xiàn)在Texas Red 檢測(cè)通道有擴(kuò)增曲線(xiàn)且Ct 值≤38，可判樣品為腸道病毒陽(yáng)性，此時(shí)FAM 或VIC 通道可能為陽(yáng)性，說(shuō)明樣本為EV71 或CA16 陽(yáng)性；FAM 及VIC 通道也可能均為陰性，說(shuō)明樣本為非EV71 非CA16 的其他型別腸道病毒。
【檢測(cè)方法的局限性】
樣本檢測(cè)結(jié)果和樣本收集、處理、運(yùn)送及保存質(zhì)量有關(guān)，其中任何失誤都將會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。如果樣本處理時(shí)沒(méi)有控制好交叉污染，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】
根據(jù)產(chǎn)品分析性能評(píng)估結(jié)果，本試劑盒的分析靈敏度為 1.0×103copies/ml。與感染部位相同或感染癥狀相似的其他病原體（乙型腦炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、單純皰疹病毒、水痘病毒、腺病毒等）無(wú)交叉反應(yīng)。
【注意事項(xiàng)】
1. 本產(chǎn)品僅用于體外診斷；
2. 實(shí)驗(yàn)室管理應(yīng)嚴(yán)格按照PCR 基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范，實(shí)驗(yàn)人員必須進(jìn)行專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格分區(qū)進(jìn)行（試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)），所用消耗品應(yīng)滅菌后一次性使用，實(shí)驗(yàn)操作的每個(gè)階段使用專(zhuān)用的儀器和設(shè)備，各區(qū)各階段用品不能交叉使用；
3. 為試劑和標(biāo)本準(zhǔn)備階段提供生物安全柜，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中穿工作服，帶一次性手套，使用自卸管移液器；
4. 試劑使用前要wan全解凍，8,000rpm 離心數(shù)秒后使用；
5. 標(biāo)本制備區(qū)所用過(guò)的吸頭請(qǐng)打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄；
6. 實(shí)驗(yàn)完畢用 10%次氯酸或 75%酒精處理工作臺(tái)和移液器,然后用紫外線(xiàn)燈照射 20－30 分鐘；
7. 本試劑盒內(nèi)陽(yáng)性質(zhì)控品應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，操作和處理均需符合相關(guān)法規(guī)要求：衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則》和《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》。
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