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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | YLK10378P | 應用領域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
| 主要用途 | 科研實驗 | 英文名稱 | Rickettsia spp. Probe qPCR Kit |
| 保存條件 | 低溫運輸，-20℃保存 | 有效期 | 12個月 |
| 試劑盒說明 | 不同批號的試劑盒組分不可交互使用 |
立克次氏體通用探針法熒光定量PCR試劑盒
商品名稱：立克次氏體通用探針法熒光定量PCR試劑盒
Name ：Rickettsia spp. Probe qPCR Kit
立克次氏體（Rickettsia）為革蘭氏陰性菌，是一類專性寄生于真核細胞內(nèi)的 G原核生物。是介于細菌與病毒之間，而接近于細菌的一類原核生物。一般呈球狀或桿狀,是專性細胞內(nèi)寄生物，主要寄生于節(jié)肢動物，有的會通過蚤、虱、蜱、螨傳入人體、如斑疹傷寒、戰(zhàn)壕熱。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術為基礎開發(fā)的專門檢測立克次氏體的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)立克次氏體通用高度保守區(qū)設計。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研。
【試劑組成】
成 份 | 五孔盒包裝 |
2×Probe qPCR MagicMix | 500μL（本色蓋） |
熒光 PCR 專用模板稀釋液 | 1mL（黃蓋） |
立克次氏體探針法 qPCR引物-探針混合液 | 150μL（棕色管） |
立克次氏體qPCR 陽性對照(1×10E7 拷貝/μL) | 50μL（黃蓋） |
使用手冊 | 1 份 |
【儲存條件及有效期】
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
【自備試劑】樣品 DNA。
【使用方法】
一、稀釋PCR 陽性對照（以10E1-10E6 拷貝/μL 這6個10倍稀釋度為例）
如果做定性實驗，則此步可以跳過。如果做定量實驗，則需要稀釋陽性對照做標準曲線。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。本產(chǎn)品只提供 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 6 號管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照（試劑盒提供），充分震蕩 1 分鐘， 得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 4 號管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照（上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是樣品制備 PC（樣品制備陽性對照），一個是樣品制備 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?span> 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為樣品制備 PC。另外用水作為樣品制備 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA/提取試劑盒兼容。
二、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9. 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記 N+9個PCR 管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于 PCR 陽性對照（用第4號管中的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為描述操作步驟，
在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設 置陽性對照，并且陽性對照樣
10. 品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
成分 | 樣品管 N+2 個 | PCR 陰性對照管 | 標準曲線 樣品管（1-6 管） |
2×Probe qPCR MagicMix | 10μL | 10μL | 各 10μL |
立克次氏體探針法qPCR 引物混合液-探針混合液 | 3μL | 3μL | 各 3μL |
N+2 個待測 DNA模板 | 7μL | 不加 | 不加 |
超純水 | 不加 | 7μL | 不加 |
第 6 步所得標準曲線樣品稀釋液（1-6 號） |
不加 |
不加 | 各7μL（1 號樣到1 號管，2 號樣到2 號管…） |
11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR：
過程 | 溫度 | 時間 |
預變性 | 95℃ | 5min |
qPCR 反應 （40 個循環(huán)） | 95℃ | 15sec |
60℃ | 1min（采集 FAM 通道的熒光信號） |
四、數(shù)據(jù)處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 35。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
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