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供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50T |
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貨號 | YLK10013P | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
主要用途 | 科研實(shí)驗(yàn) | 英文名稱 | Avian?adenovirus?C?type?4?Detection?Kit |
保存條件 | -20℃±5℃,避光保存 | 有效期 | 12個月 |
FADV-C-4?反應(yīng)液 | 500μL×2?管 | FADV-C-4?陽性質(zhì)控品 | 50μL?×1?管 |
禽腺病毒C種4型(FADV-C-4)熒光PCR試劑盒
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱:禽腺病毒C種4型(FADV-C-4)熒光PCR試劑盒
Name :Avian adenovirus C type 4 Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒
【預(yù)期用途】
禽腺病毒 C 種 4 型(Avian adenovirus C type 4 , FADV-C-4)屬于腺病毒科禽腺病毒屬,為雙鏈 DNA 病毒,分為 3 個群。自 2013 年,國內(nèi)雞群由禽腺病毒(FADV)引起的包涵體肝炎、心包積液病例逐漸增多[1]。而到 2015 年,高致病性血清4型 FADV 引起的肝炎-心包積綜合癥已在國內(nèi)雞群爆發(fā),對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅[2-3]。
本試劑盒適用于檢測的禽類動物肺、脾、腦等組織、呼吸道分泌物、全血等標(biāo)本中禽腺病毒 C 種 4 型 DNA, 適用于禽腺病毒 C 種 4 型感染的輔助診斷。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒用一對禽腺病毒 C 種 4 型特異性引物,結(jié)合一條特異性熒光探針,用一步法熒光PCR 技術(shù)對禽腺病毒 C 種 4 型病毒 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。
【試劑組成】
包裝規(guī)格 | 25T/盒 | 50T/盒 |
FADV-C-4 反應(yīng)液 | 500μL×1 管 | 500μL×2 管 |
酶液 | 25μL×1 管 | 50μL×1 管 |
FADV-C-4 陽性質(zhì)控品 | 50μL ×1 管 | 50μL ×1 管 |
陰性質(zhì)控品 | 250μL ×1 管 | 250μL ×1 管 |
注:
1) 不同批號試劑不能混用。
2) 試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次,有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標(biāo)本采集】
病死或撲殺禽,取肺、脾、腦等組織;待檢活禽,用棉拭子取呼吸道分泌物,放于 1mL50%甘油生理鹽水中;用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管。
【保存和運(yùn)輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸, 嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1 樣本前處理
每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g,手術(shù)/剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中;棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中;全血樣品待血凝后取血清 100μL,置于 1.5mL 離心管中。
1.2 核酸提取
推薦采用公司生產(chǎn)的核酸提取/或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進(jìn)行核酸提取,請按 照試劑說明書進(jìn)行操作。
2. 試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,多配制 1 份),每測試反應(yīng)體系配制如下表:
試劑 | NDV 反應(yīng)液 | 酶液 |
用量 | 20μL | 1μL |
將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,21uL/管。
3. 加樣(樣本處理區(qū))
將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,
短暫離心。
4. PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))
4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);
4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置Baseline 和 Threshold:一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。
5.2 結(jié)果判斷
陽性:檢測通道 Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線;
可疑:檢測通道 35<Ct 值≤38,建議重復(fù)檢測,如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38,且曲線有明顯的增長曲線, 判定為陽性,否則為陰性;
陰性:樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。
6. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品:Ct>38 或無 Ct 值顯示;
陽性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無效。
7. 檢測方法的局限性
1. 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);
2. 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;
3. 陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會導(dǎo)致假陽性結(jié)果;
4. 病原體在流行過程中基因突變、重組,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
5. 不同的提取方法存在提取效率差異,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
6. 試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果;
7. 本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項(xiàng)】
1. 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行;
2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,wan全混勻并短暫離心;
3. 反應(yīng)液應(yīng)避光保存;
4. 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;
6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;
7. 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;
8. 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
【參考文獻(xiàn)】
[1] 趙繼勛.Ⅰ群禽腺病毒感染的流行病學(xué)探究與防控認(rèn)識[J]. 北方牧業(yè), 2017(6): 18.
[2] 楚電峰, 劉相娥, 薄智勇, 等.Ⅰ群禽腺病毒的流行病學(xué)和防控研究現(xiàn)狀[J]. 中國動物檢疫, 2017,34(5): 86-89.
[3] 王亞楠, 韓濤, 李純玲, 等. 禽腺病毒Ⅰ群的研究現(xiàn)狀[J]. 中國動物保健, 2017, 19(1): 61-64.
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