細(xì)胞復(fù)蘇、傳代與凍存操作流程
儀器 | 試劑 | 耗材 |
離心機(jī) | 胎牛血清（FBS） | 離心管（15ml、50ml） |
生物安全柜 | 無菌 1×PBS pH=7.2 | T-25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶 |
電動移液器 | 0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA | 一次性無菌移液管（2ml、5ml、10ml） |
CO2 培養(yǎng)箱 | wan全培養(yǎng)基（含血清） | 1.8mL 凍存管 |
倒置顯微鏡 | 凍存液：90%FBS+10%DMSO | 程序降溫盒 |
恒溫水浴鍋 | ||
超低溫冰箱 |
復(fù)蘇
1）將恒溫水浴鍋中的水預(yù)熱到 37℃；
2
）準(zhǔn)備一支 15ml 離心管，加入 5ml 含 10%FBS 的wan全培養(yǎng)基，放入 37℃水浴鍋中預(yù)熱；
3
）戴上護(hù)目鏡，厚毛線手套后，從液氮罐中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞，盡快轉(zhuǎn)入 37℃恒溫水浴鍋中復(fù)溫晃動凍存管以提高復(fù)溫速率；
4
）將融化了的凍存管中的細(xì)胞吸入事先準(zhǔn)中，混勻后，1000rpm 離心 5min； 5 6
注意：從液氮中取出細(xì)胞凍存管時(shí)，若凍存管內(nèi)有液氮進(jìn)入，需擰松凍存管，排出內(nèi)部殘留的液氮，之后擰緊凍存管，置于干冰上，然后放入 37℃水浴中，避免溫差太大造成液氮快速氣化而爆炸。
傳代
（細(xì)胞傳代建議一傳二）
1.
當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到 85%以上時(shí)，可進(jìn)行傳代。
2.
在生物安全柜內(nèi)，打開培養(yǎng)瓶瓶口，收集瓶內(nèi)的培養(yǎng)基；
3.
向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入 3ml 無菌的 1×PBS 后，水平放置培養(yǎng)瓶，使 PBS 能夠浸潤到培養(yǎng)瓶底面上所有的面積，吸棄 PBS； 4. 5. 7. 8. 9.
注：如還有部分細(xì)胞未消化下來，可采用分步消化：
① 準(zhǔn)備一個(gè)無菌的 15ml 離心管，加入 2ml 含 10%FBS 的wan全培養(yǎng)基；
② 將消化下來的細(xì)胞吸入①中的離心管內(nèi)中和（避免吹打）；
③ 向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入 1ml 胰酶繼續(xù)消化 2min 左右，輕拍培養(yǎng)瓶，95%左右細(xì)胞脫落后加入 2ml 含 10%FBS 的wan全培養(yǎng)基中和，中和后的細(xì)胞懸液移入①中的離心管內(nèi)。
6.1000rpm 離心 5min；
凍存
（細(xì)胞凍存建議每瓶 T25 凍一支）
1~6
）參照傳代步驟
7）離心完成后，棄上清，用 1mL 凍存液重懸細(xì)胞沉淀，然后轉(zhuǎn)入 1.8ml 凍存管中；
8）將凍存管轉(zhuǎn)入填充滿異丙醇的程序降溫盒中，之后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中過夜降溫；
9）第二天，取出降溫完成的序降溫盒中的凍存管，盡快轉(zhuǎn)入液氮罐中保存。
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