【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：偽狂犬病毒通用型(PRV-gB)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
Name ：Pseudorabies Virus gB gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預(yù)期用途】
偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又稱豬皰疹病毒Ⅰ型、傳染性延髓麻痹病毒、奇癢癥病毒、奧葉茲基氏病病毒。是引起牛、羊、豬、犬和貓等多種家畜和野生動物發(fā)熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主要癥狀的皰疹病毒。豬是偽狂犬病的唯-一自然宿主，對其危害大?？芍氯焉锬肛i流產(chǎn)，產(chǎn)死胎及胎兒干尸化。對初生仔豬則引起神經(jīng)癥狀，出現(xiàn)運動失調(diào)，麻痹，衰竭死亡，病死率 100%。成年豬多呈隱性感染，但可引起呼吸道癥狀。病豬、帶毒豬及帶毒鼠類是本病的主要傳染源，病毒主要從病豬的鼻分泌物、唾液、乳汁和尿中排除，有的帶毒豬可持續(xù)排毒一年。
本試劑盒利用實時熒光 PCR 原理，檢測偽狂犬病毒，對偽狂犬病毒引起的疾病及其并發(fā)癥的診斷及療效評估有重要指導義。
【檢驗原理】
本試劑盒針對偽狂犬病毒gB基因高度保守區(qū)基因序列設(shè)計特異性引物和熒光探針。在反應(yīng)體系中含偽狂犬病毒gB基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進行并釋放 熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性、定量分析。
【試劑組成】
名稱規(guī)格
核酸提取液1.5mL×2 管
酶液50μL×1 管
PRV-gB 反應(yīng)液1.0mL×1 管
PRV-gB 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管
注：
1）不同批號試劑不能混用。
2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標示的檢測次數(shù)。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)丌超過 5 次，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺的豬，取腦、淋巴結(jié)、脾臟、肺臟等組織；待檢活豬，用棉拭子取鼻腔分泌物、唾液、乳汁等，置于 50%甘油生理鹽水中，或用注射器取血 5mL。
【保存和運輸】
上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但丌能超過 6 個月，標本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
組織樣品：每份組織分別從 3 個丌同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取
0. 5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；分泌物棉拭子直接取 100μL 提取；血液取血清 100μL 提取。
1.2DNA 提取
1)對上述處理好的標本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒溫處理 10min，13,000
rpm 離心 5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；
2)DNA 的提取也可以采用公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒
（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣本總數(shù)每滿 7 份，則多配制 1 頭份 PCR 反應(yīng)液)，單個測試反應(yīng)液體系配制如下表：
試劑PRV-gB 反應(yīng)液酶液
用量（樣本數(shù)為 N）20μL1μL
將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）
NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號
11 cycle95℃10min否
240 cycles94℃15sec否
55℃30sec是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、
stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，丏明顯的擴增曲線。
可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，丏出現(xiàn)明顯曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結(jié)果如果同樣出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線則為陽性，否則為陰性。
陰性：樣本檢測結(jié)果無 Ct 值丏無明顯的擴增曲線。
6.質(zhì)控標準
陰性對照：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示；
陽性對照：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，丏 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。
7.檢測方法的局限性
7.1樣本檢測結(jié)果不樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
7.2樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；
7.3陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；
7.4病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；
7.5丌同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；
7.6試劑運輸，保存丌當或試劑配制丌準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測丌準確的結(jié)果；
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心；
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服；
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
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[2]殷震，劉景華．動物病毒學[Ｍ]．北京：科學出版社，1997.
[3]朱淑芬,朱瑞良,喬彩霞.檢測偽狂犬病毒ｇＢ基因熒光定量ＰＣＲ方法的建立[J].中國獸醫(yī)學報，2012，32（10）:1413-1417.
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