甲型流感病毒 N6 亞型（IAV-N6）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光 PCR 法）
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：甲型流感病毒 N6 亞型（IAV-N6）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光 PCR 法）
Name ：Avian Influenza Virus subtype N6 Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒
【預(yù)期用途】
甲型流感病毒（Influenza A virus）為常見(jiàn)流感病毒，甲型流感病毒最容易發(fā)生變異，甲型流感病毒的亞型則被人們稱為“禽-流感"，禽-流感(Bird Flu）是由禽-流感病毒引起的一種急性傳染病，病毒基因變異后能夠感染人類， 感染后的癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數(shù)伴有嚴(yán)重的肺炎，嚴(yán)重者心、腎等多種臟器衰竭導(dǎo)致死亡，病死率很高。此病可通過(guò)消化道、呼吸道、皮膚損傷和眼結(jié)膜等多種途徑傳播，人員和車輛往來(lái)是傳播本病的重要因素。本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光 PCR 原理，檢測(cè) N6 亞型流感病毒，對(duì)甲型流感病毒 N6 亞型引起的流感診斷有重要指導(dǎo)意義。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對(duì)甲型流感病毒 N6 亞型 NA 基因高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含甲型流感病毒 N6 亞型基因組模板的情況下，PCR 反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用儀器對(duì) PCR 過(guò)程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性、定量分析。
【試劑組成】
包裝規(guī)格25T/盒50T/盒
IAV-N6 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
IAV-N6 陽(yáng)性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管
說(shuō)明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次，有效期 12 個(gè)月。
【適用儀器】
ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。
【標(biāo)本采集】
拭子樣品：采集咽喉拭子時(shí)將拭子每人喉頭及上顎裂來(lái)回刮 2 次~3 次并旋轉(zhuǎn)，取分泌液；采集泄殖腔拭子時(shí)將拭子深人泄殖腔至少旋轉(zhuǎn) 3 圈并沾取少量糞便；將采樣后的拭子分別放入盛有 1.2 mL 樣品稀釋液（配制方法見(jiàn) GB/T 18936-2020 高致病性禽-流感診斷技術(shù)）的 2 mL 采樣管中，編號(hào)并填寫相應(yīng)采樣單。
發(fā)病禽鳥可無(wú)菌采集氣管、肺、腦、腸（包括內(nèi)容物）、肝、脾、腎、心等組織臟器，裝入 15 mL 或 50 mL
帶螺口的有機(jī)材料保存管中，編號(hào)并填寫相應(yīng)采樣單。
【保存和運(yùn)輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò) 24 h；若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置-70℃以下保存，凍融不超過(guò) 3 次。。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
將棉拭子充分捻動(dòng)、擠干后棄去拭子；糞便，研碎的組織加 PBS 充分研磨，按照 1g 組織加 10 mL PBS 的比例配成懸液。樣品液經(jīng) 3 000 r/min 離心 10 min，取上清作為核酸檢測(cè)材料。
1.2核酸提取
推薦采用公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取， 請(qǐng)按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。
2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑IAV-N6 反應(yīng)液酶液
用量19μL1μL
將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，20μL/管。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。
4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇：
檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光， 選擇 None 即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號(hào)
11 cycle50℃10min否
21 cycle95℃2min否
345 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請(qǐng)參照各儀器使用說(shuō)明書進(jìn)行設(shè)置，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整，Start 值可設(shè)在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線），點(diǎn)擊 Analyze 自動(dòng)獲得分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線； 陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>40 或無(wú) Ct 值。
5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：無(wú)特異性擴(kuò)增曲線或無(wú) Ct 值顯示；
陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
6.檢測(cè)方法的局限性
1.樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
2.樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；
3.陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；
4.病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
6.試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；
7.本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。
【注意事項(xiàng)】
1.所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心；
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；
7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
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