【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：甲型流感病毒（IAV）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
Name ：Avian Influenza Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預期用途】
甲型流感是由甲型流感病毒(AIV)引起的一種禽類傳染病，雞、火雞、鴨和鵪鶉等家禽均可感染，發(fā)病情況差別較大，有的出現(xiàn)急性死亡，有的無癥狀帶毒。水禽是 AIV 的自然宿主，也是流感病毒的天然基因庫，幾乎所有亞型的流感病毒都可以在水禽中分離到[1]。在世界范圍內(nèi)，家禽中流行的主要有 H5、H6、H7、H9 等亞型。H5 和 H7 亞型的某些毒株可以造成禽類很高的發(fā)病率和死亡率，被稱為高致病性甲型流感(HPAI)病毒。OIE 將高致病性甲型流感列為 A 類動物疫病，我國也將其列為一類動物疫病[2-3]。
本試劑盒利用實時熒光 PCR 原理，檢測甲型流感病毒，對甲型流感診斷有重要指導意義。
【檢驗原理】
本試劑盒針對甲型流感病毒 M 基因高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在反應體系中含甲型流感病毒基因組模板的情況下，PCR 反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對 PCR 過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性、定量分析。
【試劑組成】
包裝規(guī)格50T/盒
IAV 反應液500μL×2 管
酶液50μL×1 管
IAV 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管
注：1）不同批號試劑不能混用。
2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標示的檢測次數(shù)。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺動物，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活動物，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。
【保存和運輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存，應放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2核酸提取
推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑（離心柱法）進行核酸提取，請按照試劑說明書 進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑IAV 反應液酶液
用量19μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，20μL/管。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇：
檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光， 選擇 None 即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號
11cycle50℃10min否
21 cycle95℃2min否
345 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可設在 3～15、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。
5.3質(zhì)控標準
陰性質(zhì)控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
6.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；
3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；
4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；
6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；
7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；
3.反應液應避光保存；
4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
[1]Webster R G, Bean W J, Gorman O T, et al. Evolution and ecology of influenza A viruses [J]. Microbiological Reviews, 1992, 56(1): 152-179.
[2]Shortridge K. Avian influenza A viruses of southern China and Hong Kong: ecological aspects and implications for man [J]. Bulletin of the World Health Organization, 1982, 60(1): 129.
[3] 張燁, 舒躍龍. 2004–2012 年我國甲型流感流行情況 [J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志, 2013, 27(3): 239-240.
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