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          產(chǎn)蛋下降綜合征病毒(EDSV)核酸檢測試劑盒說明書

          閱讀:101      發(fā)布時(shí)間:2024-10-27
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          產(chǎn)蛋下降綜合征病毒(EDSV)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)

          【產(chǎn)品名稱】

          商品名稱:產(chǎn)蛋下降綜合征病毒(EDSV)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)

          Name:Egg drop syndrome virus Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

          【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

          【預(yù)期用途】

          雞產(chǎn)蛋下降綜合征(Egg drop syndrome,EDS)又稱為減蛋綜合征-76(Egg drop syndrome-76,EDS-76)。雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒(EDSV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬 III 群(Avian adenovirus Group III),是一種無包膜的雙股 DNA 病毒,主要引起一種以產(chǎn)蛋禽類產(chǎn)薄殼或無殼蛋,產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降為主要特征的傳染病。

          本試劑盒適用于檢測輸卵管、子宮的黏膜、卵巢和泄殖腔拭子等標(biāo)本中產(chǎn)蛋下降綜合征病毒 DNA,適用于產(chǎn)蛋下降綜合征病毒感染的輔助診斷。

          【檢驗(yàn)原理】

          本試劑盒用一對產(chǎn)蛋下降綜合征病毒特異性引物,結(jié)合一條特異性熒光探針,用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測,用于臨床上對可疑感染病料的病原學(xué)診斷。

          【試劑組成】

          包裝規(guī)格25T/盒50T/盒

          EDSV 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管

          酶液25μL×1 管50μL×1 管

          EDSV 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管

          陰性質(zhì)控品250μL×1 管250μL ×1 管

          說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

          【儲(chǔ)存條件及有效期】

          -20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融不超過 5 次,有效期 12 個(gè)月。

          【適用儀器】

          ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

          【標(biāo)本采集】

          撲殺疑似感染禽,采集輸卵管、子宮黏膜、卵巢等組織,置于無菌離心管內(nèi)備用。  疑似減產(chǎn)禽,采集泄殖腔拭子,將拭子深入泄殖腔至少旋轉(zhuǎn) 3 圈并沾取少量糞便。

          【保存和運(yùn)輸】

          采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24h;若需長期保存,應(yīng)放置-70℃以下保存,凍融不超過 3 次。

          【使用方法】

          1.樣品處理(樣本處理區(qū))

          1.1樣本前處理

          組織樣品:取適量組織樣品,研磨,按照 1g 組織加 5mL PBS 制成混懸液,3000r/min 離心 10min,取上清用于后續(xù)的核酸提取。

          拭子樣品:將拭子浸入 5mL PBS 中充分渦旋震蕩 1min,反復(fù)擠壓拭子,棄去拭子,將浸出液 3000r/min 離心 5min,取上清用于后續(xù)的核酸提取。

          1.2核酸提取

          推薦采用優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進(jìn)行核酸提取,請   按照試劑說明書進(jìn)行操作。

          2.試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

          根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,多配制 1 份),每測試反應(yīng)體系配制如下表:

          試劑EDSV 反應(yīng)液酶液

          用量19μL1μL

          將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,20μL/管。

          3.加樣(樣本處理區(qū))

          將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

          4.PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))

          4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);

          4.2設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;熒光通道選擇:

          檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光, 選擇 None 即可。

          4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

          步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號

          11 cycle95℃2min

          245 cycles95℃15sec

          60℃30sec

          5.結(jié)果分析判定

          5.1結(jié)果分析條件設(shè)定(請參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置,以分析 ABI7500 儀器為例)

          反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整,Start 值可設(shè)在 3~15、End 值可設(shè)在 5~20,使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期,陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線),點(diǎn)擊 Analyze 自動(dòng)獲得分析結(jié)果。

          5.2結(jié)果判斷

          陽性:檢測通道 Ct 值≤40,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線; 陰性:樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

          5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

          陰性質(zhì)控品:無特異性擴(kuò)增曲線或無 CT 值;

          陽性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期,且Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

          6.檢測方法的局限性

          1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);

          2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果;

          3.陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果;

          4.病原體在流行過程中基因突變、重組,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

          5.不同的提取方法存在提取效率差異,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

          6.試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果;

          7.本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

          【注意事項(xiàng)】

          1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行;

          2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,完-全混勻并短暫離心;

          3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存;

          4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

          5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;

          6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;

          7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器;

          8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

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          優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司

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