禽腺病毒 C 種 4 型（FADV-C-4） 核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
【產品名稱】
商品名稱：禽腺病毒 C 種 4 型（FADV-C-4）核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法) Name ：Avian adenovirus C type 4 Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒
【預期用途】
禽腺病毒 C 種 4 型(Avian adenovirus C type 4 , FADV-C-4)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，為雙鏈 DNA 病毒，分為 3 個群。自 2013 年，國內雞群由禽腺病毒（FADV）引起的包涵體肝炎、心包積液病例逐漸增多[1]。而到 2015 年，高致病性血清４型 FADV 引起的肝炎－心包積綜合癥已在國內雞群爆發(fā)，對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展構成嚴重威脅[2-3]。
本試劑盒適用于檢測的禽類動物肺、脾、腦等組織、呼吸道分泌物、全血等標本中禽腺病毒 C 種 4 型 DNA， 適用于禽腺病毒 C 種 4 型感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒用一對禽腺病毒 C 種 4 型特異性引物，結合一條特異性熒光探針，用一步法熒光PCR 技術對禽腺病毒 C 種 4 型病毒 DNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
包裝規(guī)格25T/盒50T/盒
FADV-C-4 反應液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
FADV-C-4 陽性質控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質控品250μL ×1 管250μL ×1 管
注：
1）不同批號試劑不能混用。
2）試劑盒內各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標示的檢測次數(shù)。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺禽，取肺、脾、腦等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物，放于 1mL50%甘油生理鹽水中；用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸， 嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；全血樣品待血凝后取血清 100μL，置于 1.5mL 離心管中。
1.2核酸提取
推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請按 照試劑說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑NDV 反應液酶液
用量20μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，
短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號
11 cycle95℃10min否
240 cycles94℃15sec否
55℃30sec是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；
可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線， 判定為陽性，否則為陰性；
陰性：樣本檢測結果 Ct 值>38 或無 Ct 值。
6.質控標準
陰性質控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
7.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果；
3.陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果；
7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行；
2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；
3.反應液應避光保存；
4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
[1]趙繼勛.Ⅰ群禽腺病毒感染的流行病學探究與防控認識[J]. 北方牧業(yè), 2017(6): 18.
[2]楚電峰, 劉相娥, 薄智勇, 等.Ⅰ群禽腺病毒的流行病學和防控研究現(xiàn)狀[J]. 中國動物檢疫, 2017,34(5): 86-89.
[3]王亞楠, 韓濤, 李純玲, 等. 禽腺病毒Ⅰ群的研究現(xiàn)狀[J]. 中國動物保健, 2017, 19(1): 61-64.
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