禽傳染性喉氣管炎病毒(AILTV)核酸檢測(cè)試劑盒（熒光 PCR 法）
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：禽傳染性喉氣管炎病毒(AILTV)核酸檢測(cè)試劑盒（熒光 PCR 法）
Name：Diagnostic Kit for avian infectious laryngotracheitis virus DNA（Real-Time PCR Method）
【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒適用于檢測(cè)雞肺組織、口咽或氣管分泌物等樣本中的雞傳染性喉氣管炎病毒，用于雞傳染性喉氣 管炎病毒感染的輔助診斷，其檢測(cè)結(jié)果僅供參考。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒采用 TaqMan 探針法實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)，設(shè)計(jì)一對(duì)雞傳染性喉氣管炎病毒特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術(shù)對(duì)雞傳染性喉氣管炎病毒的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用于臨床上對(duì)可疑感染病料的病原學(xué)診斷。
【試劑組成】
包裝規(guī)格25T/盒50T/盒
AILTV 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
AILTV 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管
說明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個(gè)月。
【適用儀器】
ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。
【標(biāo)本采集】
病死或撲殺禽，取喉頭、氣管、肺組織；活禽用棉拭子取口咽或氣管分泌物，放于 50%甘油生理鹽水中。
【保存和運(yùn)輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
組織樣品：每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨， 加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100μL。
1.2核酸提取
推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取， 請(qǐng)按照試劑說明書進(jìn)行操作。
2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽性對(duì)照；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑AILTV 反應(yīng)液酶液
用量（樣本數(shù)為 N）19μL1μL
將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，20μL/管。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。
4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；
熒光通道選擇： 檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號(hào)
11 cycle95℃2min否
245 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請(qǐng)參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整，Start 值可設(shè)在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線），點(diǎn)擊 Analyze 自動(dòng)獲得分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
陽性：檢測(cè)通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線； 陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。
5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：無特異性擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。
6.檢測(cè)方法的局限性
1.樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果；
3.陽性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果；
4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
6.試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；
7.本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。
【注意事項(xiàng)】
1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心；
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；
7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
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