多功能氧化酶（(mixed function oxidase，MFO）試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
多功能氧化酶又稱混合功能氧化酶，可產(chǎn)生降解反應(yīng)，可使原化學(xué)物質(zhì)變?yōu)榈投镜幕驘o毒的物質(zhì)從體內(nèi)排出；還可產(chǎn)生激活反應(yīng)，可使原化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有親電子性質(zhì)，導(dǎo)致毒性增強，成為致突變物或終致癌物。近年來對混合功能氧化酶系與外源性化學(xué)物質(zhì)相互作用的深入研究，對于從分子生物學(xué)水平上進一步了解外源性化學(xué)物質(zhì)的毒作用具有重要意義。
測定原理：
MFO催化對硝基苯甲醚產(chǎn)生對硝基苯酚，在400nm下有特征吸光值。
自備用品：
酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰、蒸餾水、氯仿。
試劑組成和配制：
提取液：液體120mL×1瓶，4℃保存;
試劑一：液體24mL×1瓶，4℃避光保存;
試劑二：粉劑×3管，-20℃保存；臨用前取一管加入1.5mL水溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。
試劑三：液體24mL×1瓶，4℃保存;
試劑四：液體64mL×1瓶，4℃保存。
粗酶液提取：
按照組織質(zhì)量（g）：提取液（mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。12000g 4℃離心20min，取上清，置冰上待測。
測定步驟：
1、 酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至400nm。
2、在EP管中依次加入如下試劑
試劑名稱（μL） | 測定 | 空白 |
試劑一 | 200 | 200 |
試劑二 | 40 | 40 |
提取液 | 160 | 360 |
樣本 | 200 | |
混勻，37℃水浴30min | ||
試劑三 | 200 | 200 |
分別加入1000μL氯仿，充分混勻萃取，靜置10min，取下層氯仿層0.6mL至新的EP管中。再加入試劑四0.6mL，充分混勻萃取，取上層水相0.2mL于96孔板中，400nm下測定吸光值A測定與A空白，△A=A測
定-A空白?？瞻坠苤恍铚y一管。
MFO活性計算:
標準曲線：y = 0.0119x + 0.0021，R2 = 0.9997；y，吸光度；x,標準品濃度，單位nmol/mL。
（1）按樣本質(zhì)量計算
單位定義：每g樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
MFO（nmol/min/g 鮮重）=（△A-0.0021）÷0.0119×V總÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=8.4×（△A-0.0021）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
MFO（nmol/min/mg prot）=（△A-0.0021）÷0.0119×V總÷(V樣×Cpr)÷T
=8.4×（△A-0.0021）÷Cpr
V總：最終萃取液體積，0.6 mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，200μL；T：反應(yīng)時間，30min；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL。
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