多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）試劑盒說明書
微量法100管/48樣
注 意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
PPO（EC1.10.3.1）主要存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是一種含銅的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化產(chǎn)生醌，從而引起褐化，與果蔬加工、茶葉品質(zhì)和組培等密切相關(guān)。
測定原理：
PPO能夠催化鄰苯二酚產(chǎn)生醌，后者在525nm有特征光吸收。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：100mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：20mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：5mL×1瓶，4℃保存；
粗酶液提?。?/span>
1、細菌、細胞或組織樣品的制備：
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）或果汁樣本的處理：
按照血清（漿）或果汁體積（mL）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清（漿）或果汁加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟：
1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至525nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測定（在EP管中依次加入下列試劑）
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 |
樣本 | 50 | |
煮沸的樣本 | 50 | |
試劑一 | 200 | 200 |
試劑二 | 50 | |
蒸餾水 | 50 |
37℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）中準確水浴10min后，95℃水浴5min，冷卻至室溫，10000g，25℃離心10min，收集上清，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，525nm處檢測測定管和對照管吸光度，計算ΔA=A測定-A對照。
注意：煮沸樣本的操作：取300μL離心上清于EP管中，進行5min 95℃水浴處理；每個測定管需要設(shè)一個對照管，可以在不同對照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集中進行5min 95℃水浴處理。
PPO活性計算：
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、血清（漿）或果汁PPO活性
單位的定義：每分鐘每mL血清（漿）或果汁在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化
0.01為一個酶活力單位。
PPO（U/mL）=ΔA×V反總÷(V液× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =60×ΔA÷V液
2、組織、細菌或細胞PPO活性
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個
酶活力單位。
PPO（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =60×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）按樣本鮮重計算：
單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個
酶活力單位。
PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =60×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位定義：每分鐘每1萬個細菌或細胞在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個酶活力單位。
PPO（U/104 cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =0.12×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；V液：加入血清（漿）或果汁體積，0.1mL； V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
1、血清（漿）或果汁PPO活性
單位的定義：每分鐘每mL血清（漿）或果汁在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化
0.005為一個酶活力單位。
PPO（U/mL）=ΔA×V反總÷(V液× V樣÷V樣總)÷0.005÷T =120×ΔA÷V液
2、組織、細菌或細胞PPO活性
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個
酶活力單位。
PPO（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.005÷T =120×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）按樣本鮮重計算：
單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個
酶活力單位。
PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.005÷T =120×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位定義：每分鐘每1萬個細菌或細胞在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個酶活力單位。
PPO（U/104 cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.005÷T =0.24×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；V液：加入血清（漿）或果汁體積，0.1mL； V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。
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