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乳酸含量（lactic acid，LA）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100T/48S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

乳酸是生物體代謝過(guò)程中重要的中間產(chǎn)物，與糖代謝、脂類(lèi)代謝、蛋白質(zhì)代謝及細(xì)胞內(nèi)能量代謝密切相關(guān)，乳酸含量是評(píng)估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標(biāo)。

測(cè)定原理：

乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸，同時(shí)使NAD+還原生成NADH 和H+，H+傳遞給PMS

生成的 PMSH2 還原 INT 生成紅色物質(zhì)，在 530nm 處有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、研缽、離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制：

提取液：液體 110mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 2mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1 支，-20℃避光保存。臨用前加入 0.6mL 蒸餾水充分溶解。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加 6mL 蒸餾水充分溶解。

試劑五：粉劑×1 支，4℃避光保存。標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1mL×1 支，4℃保存。

顯色液：臨用前根據(jù)用量按照提取液（V）：試劑三（V）：試劑四（V）：試劑五（m）=1（mL)： 0.3（mL)：3（mL)：15（mg）的比例充分混勻。（注意：現(xiàn)配現(xiàn)用，用多少配多少，在棕色瓶中配制，試劑盒中帶有 4 個(gè)棕色空瓶）

樣本處理：

1.    組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1mL

提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于 4℃，12000g 離心 10min，取上清測(cè)定。

2.    細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1  的比例（建議 500萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；于 4℃，12000g 離心 10min，取上清測(cè)定。

3. 血清：直接測(cè)定。

測(cè)定操作：

注 意：標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照料管和標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定管只需測(cè)定一次，每個(gè)樣品測(cè)定管設(shè)一個(gè)樣品對(duì)照管。

計(jì)算公式：

1.按照蛋白含量計(jì)算

LA 含量（μmol/mg prot）= △A 樣÷△A 標(biāo)×C 標(biāo)÷ Cpr

= 2×△A 樣÷△A 標(biāo)÷ Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算

LA 含量（μmol/g 鮮重）= △A 樣÷△A 標(biāo)×C 標(biāo)÷ W

= 2×△A 樣÷△A 標(biāo)÷ W

3.按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

LA 含量（μmol/104 cell）= △A 樣÷△A 標(biāo)×C 標(biāo)÷ 細(xì)胞數(shù)量

= 2×△A 樣÷△A 標(biāo)÷ 細(xì)胞數(shù)量

4.按照液體體積計(jì)算

LA 含量（μmol/mL）= △A 樣÷△A 標(biāo)×C 標(biāo)

= 2×△A 樣÷△A 標(biāo)

C 標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，2mmol/L；W：樣本質(zhì)量，g/mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL

注意事項(xiàng)：

1.若吸光值超過(guò) 2，請(qǐng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤龠M(jìn)行測(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2.Z低檢出限為 1.8μmol/L。

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