檸檬酸（citric acid, CA）含量測定試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
CA是生物體內(nèi)常見的有機酸，是重要的食品風味物質(zhì)。此外，CA是三羧酸循環(huán)第一步反應的產(chǎn)物。
測定原理：
酸性條件下，檸檬酸還原Cr6+生成Cr3+，在545nm處有特征吸收峰；通過測定545nm吸光值的增加，即可計算出樣品中檸檬酸含量。
自備儀器和用品：
低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑組成和配置：
試劑一：液體×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體×1瓶，4℃保存。
試劑三：液體×1管，－20℃保存。
試劑四：粉劑×1管，室溫保存。臨用前配制，加入2mL試劑一，充分溶解。
試劑五：液體×1管，4℃避光保存。
標準品：液體×1管，250μmol/L檸檬酸標準液，4℃保存。
樣品中檸檬酸提?。?/p>
1. 液體樣品中檸檬酸提取：取0.1mL液體加試劑一0.9mL，充分混勻，11000g， 4℃離心10min，取上清液，待測。
2. 組織中檸檬酸提?。喊凑战M織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。11000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。
3. 線粒體中檸檬酸提?。喊凑战M織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿，600g/min，4℃離心5min；取上清至另一EP管中，11000g，4℃離心10min，棄上清（此上清液可用于細胞質(zhì)CA含量測定）；向沉淀中加試劑二200μl，以及試劑三2μl，充分懸浮溶解，11000g，4℃離心10min，取上清液，待測。
4. 細菌、真菌中：按照細胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；11000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。
測定操作：
1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調(diào)節(jié)波長到545 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑一置于30℃水浴中預熱30min。
3. 空白管：取0.5 mL EP管，依次加入20μL蒸餾水，140μL試劑一，20μL試劑四，20μL試劑五，混勻后室溫靜置30min，于545nm測定吸光度，記為A空白管。
4. 標準管：取0.5 mL EP管，依次加入20μL標準液，140μL試劑一，20μL試劑四，20μL試劑五，混勻后室溫靜置30min，于545nm測定吸光度，記為A標準管。
5. 測定管：取0.5 mL EP管，依次加入20μL上清液，140μL試劑一，20μL試劑四，20μL試劑五，充分混勻后室溫靜置30min，于545nm測定吸光度，記為A測定管。
注意：空白管和標準管只需測定一次。
計算公式：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1. 按液體樣品的體積計算
檸檬酸含量（nmol/L）= [C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×樣品稀釋倍數(shù)×V總
= 2500×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)
C標準液：250μmol/L=0.25 m mol/L；樣品稀釋倍數(shù)：（0.1 mL樣品+0.9mL試劑一）÷ 0.1 mL樣品=10；V總：1mL。
2. 按組織質(zhì)量計算
檸檬酸含量（nmol/g 鮮重）= [C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V總÷W
= 250×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷W
C標準液：250 μ mol/L；V總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L；W：樣品質(zhì)量，g。
3. 按蛋白含量計算
檸檬酸含量（nmol/mg prot）= [C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]÷Cpr
= 250×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷Cpr
C標準液：250 μ mol/L=0.25μ mol/mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)含量，mg/mL。
4. 按細胞數(shù)量計算
檸檬酸含量（nmol/104 cell）= [C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V總÷細胞數(shù)量
= 250×(A測定管－A空白管) ÷(A標準管－A空白管) ÷細胞數(shù)量
C標準液：250 μ mol/L；V總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L；
b.使用96孔板測定的計算公式如下
3. 按液體樣品的體積計算
檸檬酸含量（nmol/L）= [C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×樣品稀釋倍數(shù)×V總
= 2500×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)
C標準液：250μmol/L=0.25 m mol/L；樣品稀釋倍數(shù)：（0.1 mL樣品+0.9mL試劑一）÷ 0.1 mL樣品=10；V總：1mL。
4. 按組織質(zhì)量計算
檸檬酸含量（nmol/g 鮮重）= [C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V總÷W
= 250×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷W
C標準液：250 μ mol/L；V總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L；W：樣品質(zhì)量，g。
5. 按蛋白含量計算
檸檬酸含量（nmol/mg prot）= [C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]÷Cpr
= 250×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷Cpr
C標準液：250 μ mol/L=0.25μ mol/mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)含量，mg/mL。
6. 按細胞數(shù)量計算
檸檬酸含量（nmol/104 cell）= [C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V總÷細胞數(shù)量
= 250×(A測定管－A空白管) ÷(A標準管－A空白管) ÷細胞數(shù)量
C標準液：250 μ mol/L；V總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L；
注意事項：
1. 樣品處理等過程均需要在冰上進行。
2. 試劑四需現(xiàn)配現(xiàn)用，配置好的一周內(nèi)使用完；
3. 試劑五為易致癌物質(zhì)，實驗過程中，需佩戴手套，避免試劑五濺到皮膚上。
4. 檸檬酸提取液不能用于蛋白含量測定，如需測定蛋白含量，需另取組織，使用本公司BCA試劑盒進行測定。
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