土壤中性蛋白酶（S-NPT）試劑盒說明書
微量法100管/48樣
注 意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
土壤蛋白酶參與土壤中存在的氨基酸、蛋白質(zhì)以及其他含蛋白質(zhì)氮的有機(jī)化合物的轉(zhuǎn)化，其水解產(chǎn)物是高等植物的氮源之一。S-NPT在中性環(huán)境下催化蛋白質(zhì)水解，與土壤有機(jī)質(zhì)含量、氮素及其他土壤性質(zhì)有關(guān)。
測(cè)定原理：
中性條件下，S-NPT可將酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸；在堿性條件下，酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍(lán)；在680nm有特征吸收峰。
實(shí)驗(yàn)中所需儀器及設(shè)備：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/96孔板、雙蒸水
試劑組成和配置：
試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入6ml蒸餾水充分溶解；用不完的試劑4℃保存；
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入2mL試劑七，沸水浴加熱溶解，然后加入8ml試劑一，充分混勻備用，用不完的試劑4℃保存；
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入30ml蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑4℃保存；
試劑五：液體8mL×1瓶，4℃保存；
試劑六：液體1.5mL×1支，0.05mg/ml標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液，4℃保存；
試劑七：液體5mL×1瓶，4℃保存；
樣品處理：
新鮮土樣自然風(fēng)干或37度烘箱風(fēng)干，過30~50目篩。
測(cè)定操作：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至680nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定：
試劑名稱 | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 |
風(fēng)干土樣（g） | 0.02 | 0.02 |
試劑一（μL） | 150 | |
試劑三（μL） | 150 |
混勻后，40℃水浴30min，振蕩5-6次，使土樣與反應(yīng)液充分接觸
試劑二（μL） | 50 | 50 |
混勻，8000g 25℃離心10min，取上清液，在EP管中加入下列試劑
測(cè)定管 | 對(duì)照管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | |
上清液（μL） | 60 | 60 | |
試劑六（μL） | 60 | ||
試劑四（μL） | 280 | 280 | 280 |
試劑五（μL） | 60 | 60 | 60 |
混勻，40℃水浴20min，8000g 25℃離心10min，取上清液200μL，680nm下讀取各管吸光值A
注意：標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)一次。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
S-NPT活性計(jì)算：
單位定義：每天每g土樣中產(chǎn)生1mg酪氨酸為一個(gè) S-NPT活力單位。
S-NPT(mg/d/g土樣)=C標(biāo)準(zhǔn)×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管×V反總÷W÷T=24×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管
C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.05mg/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.4mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min=1/48d； W：樣本質(zhì)量，0.02g。
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