土壤硝酸還原酶（Solid-Nitrate Reductase，S-NR）試劑盒說明書
微量法100管/48樣
注 意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
S-NR催化土壤中硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，是土壤硝態(tài)氮還原的關(guān)鍵酶。研究S-NR的活性對合理施肥，降低氮素的損失具有重要意義。
測定原理：
S-NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋ +H 2 O；產(chǎn)生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下，與對–氨基苯磺酸及 α - 萘胺定量生成紅色偶氮化合物；生成的紅色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法測定。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：液體12mL×1瓶，-20℃保存。
試劑二：液體8mL×1瓶，-20℃保存。
試劑三：液體9mL×1瓶，4℃保存（如出現(xiàn)結(jié)晶析出，60℃-90℃水浴溶解后使用）。
試劑四：液體9mL×1瓶，4℃保存。
試劑五：標準品儲備液1mL，-20℃保存。
0.1μmol/mL標準液的配制：用時將試劑五稀釋100倍，即取 0.1ml 加蒸餾水定容至 10ml。
樣品處理：
新鮮土樣自然風(fēng)干或37度烘箱風(fēng)干，過30~50目篩。
測定步驟：
1、分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至540nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定
試劑名稱 | 1mL帶蓋離心管 | |||
測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 | |
風(fēng)干土樣（g） | 0.06 | 0.06 | ||
0.1μmol/mL標準液（μL） | 60 | |||
蒸餾水（μL） | 225 | 285 | ||
試劑一（μL） | 225 | 225 | ||
試劑二（μL） | 75 | 75 | 75 | 75 |
混勻后，蓋蓋后37℃水浴24h，8000g 25℃離心10min，取上清液
上清液（μL） | 130 | 130 | 130 | 130 |
試劑三（μL） | 85 | 85 | 85 | 85 |
試劑四（μL） | 85 | 85 | 85 | 85 |
混勻，25℃顯色20min，4000g，25℃離心10min，取200uL上清液至微量石英比色皿或96孔板中，540nm下讀取各管吸光值。標準管和空白管只需測一次。每個測定管設(shè)一個對照管。
注意點：務(wù)必先做2個樣本的預(yù)測定，少部分土壤由于樣本特殊性可能出現(xiàn)測定管小于對照管，請及時與我司技術(shù)支持聯(lián)系，以獲得針對樣本特殊性的調(diào)整測定方法。
S-NR活性計算：
單位的定義：每天每g土樣中產(chǎn)生1μmol NO2ˉ的量為一個 S-NR活力單位。
S-NR（μmol /d/g土樣）=C標準×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）×V反總÷W÷T =0.5×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）
C標準管：標準管濃度，0.1μmol/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；T：反應(yīng)時間，24h； W：樣本質(zhì)量，0.06g。
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