注 意 ：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
吲哚乙酸（IAA）在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破壞失去活性。植物體內(nèi)吲哚乙酸氧化酶活力的大小，對調(diào)節(jié)體內(nèi)吲哚乙酸的水平，起著重要的作用，而影響植物的生長。
測定原理：
在無機酸存在情況下，吲哚乙酸能與FeCl3作用，生成紅色螯合物，該物質(zhì)在530nm處有最大吸收峰，酶活力的大小可以其破壞吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法測定。
自備儀器和用品：
低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、1.5mL離心管、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體10mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：液體10mL×1瓶，4℃保存。
試劑四：液體10mL×1瓶，4℃保存。
試劑五：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑六：液體50mL×1瓶，4℃保存。臨用前吸取1mL試劑五加入試劑六中混勻，待用，避光保存
粗酶液提?。?/span>
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體：直接測定。
測定操作：
1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到530 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二、試劑三、試劑四置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）水浴中保溫20min。
3. 取1.5mL EP管若干，按操作依次加入試劑，操作表如下：
標(biāo)準(zhǔn)管 | 測定管 | |
試劑二（μL） | 20 | 20 |
試劑三（μL） | 20 | 20 |
試劑四（μL） | 40 | 40 |
樣本上清液（μL） | 0 | 20 |
試劑一（μL） | 120 | 100 |
充分混勻后置于30°恒溫水浴中，保溫反應(yīng)30min。 | ||
實際六（μL） | 400 | 400 |
充分混勻，置于30℃黑暗水浴保溫顯色30min。取200μL顯色后呈紅色的反應(yīng)液于微量玻璃比色皿/96孔板中，用分光光度計或酶標(biāo)儀中測定波長530nm處OD值，標(biāo)準(zhǔn)管記為A1，測定管記為A2 | ||
注意：標(biāo)準(zhǔn)管只需做一次
IAA氧化酶活性計算公式：
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y = 1.334x + 0.025 R2 = 0.998 （x為IAA濃度，mmol /L；y為吸光值）
（1） 按蛋白濃度計算
酶活定義：從開始時加入的IAA量減去酶作用后殘留的IAA含量，即得被酶所催化的IAA含量。以每mg酶蛋白在1h內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/mg prot）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V樣÷（V樣×Cpr）÷T
=1.5×（A1-A2）÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計算
酶活定義：以每g樣本在1h內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/g 鮮重）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V樣÷(V樣÷V樣總×W) ÷T
=1.5×（A1-A2）÷W
（3） 按細(xì)胞數(shù)量計算
酶活定義：以每1萬個細(xì)胞在1h內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/104 cell）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V樣÷(V樣÷V樣總×W) ÷T
=1.5×（A1-A2）÷細(xì)胞數(shù)量
（4） 按液體體積計算
酶活定義：以每mL酶液在1h內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/mL）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V樣÷(V樣÷V樣總) ÷T
=1.5×（A1-A2）
V樣總：上清液總體積，1mL；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g，T：反應(yīng)時間，0.5h。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y = 0.667x + 0.025 R2 = 0.998 （x為IAA濃度，mmol /L；y為吸光值）
（1）按蛋白濃度計算
酶活定義：從開始時加入的IAA量減去酶作用后殘留的IAA含量，即得被酶所催化的IAA含量。以每mg酶蛋白在1h內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/mg prot）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V樣÷（V樣×Cpr）÷T
=3×（A1-A2）÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
酶活定義：以每g樣本在1h內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/g 鮮重）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V樣÷(V樣÷V樣總×W) ÷T
=3×（A1-A2）÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計算
酶活定義：以每1萬個細(xì)胞在1h內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/104 cell）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V樣÷(V樣÷V樣總×W) ÷T
=3×（A1-A2）÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
酶活定義：以每mL酶液在1h內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/mL）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V樣÷(V樣÷V樣總) ÷T
=3×（A1-A2）
V樣總：上清液總體積，1mL；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g，T：反應(yīng)時間，0.5h。
注意事項：
Z低檢出限為0.01μmol/mL。
(空格分隔,最多3個,單個標(biāo)簽最多10個字符)
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