線粒體復(fù)合體Ⅰ試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意：正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
復(fù)合體Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又稱 NADH-CoQ 還原酶或 NADH 脫氫酶，廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是線粒體內(nèi)膜中最大的蛋白復(fù)合物。該酶催化一對電子從 NADH 傳遞給 CoQ，同時可使 O2 還原生成 O2.-，是呼吸電子傳遞鏈上產(chǎn)生 O2.-的主要部位。測定該酶活性，不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈（ETC）狀態(tài)，而且可以反映活性氧（ROS）生成狀態(tài)。
測定原理：
復(fù)合體Ⅰ能夠催化 NADH 脫氫生成 NAD+，在 340nm 下測定 NADH 的氧化速率計算出該酶活性的大小。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：液體 100mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：液體 20mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：液體 1.5mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑四：液體 25mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑五：液體 1mL×1 支，-20℃保存；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存，用時加入 2mL 蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
工作液的配制：臨用前將試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
① 準(zhǔn)確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿 600g，4℃離心 5min。
③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。
④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅰ（此步可選做）。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于復(fù)合體Ⅰ酶活性測定。
測定步驟：
1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測定
（1）工作液于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）孵育 5min。
（2）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本、200μL 工作液和 15μL 試劑六，混勻，記錄 340nm 處初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2，計算 ΔA=A1-A2。
復(fù)合體Ⅰ活力單位的計算：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：
（1）按蛋白濃度計算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1808×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)
÷T=365×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.73×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.25×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：
比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時間，2 min；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。
b.使用 96 孔板測定的計算公式如下：
（1）按蛋白濃度計算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=3616×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)
÷T=730×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=1.46×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.25×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：
96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時間，2 min；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。
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