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          脲酶(Urease, UE)測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

          閱讀:371      發(fā)布時(shí)間:2023-04-06
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          脲酶(Urease, UE)測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                              微量法100/48

             意:正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

          測(cè)定意義:

          UE能夠水解尿素,產(chǎn)生氨和碳酸。UE活性與有機(jī)物質(zhì)含量、全氮和速效氮含量呈正相關(guān),反應(yīng)了氮素狀況。

          測(cè)定原理:

          利用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定脲酶水解尿素產(chǎn)生的NH3-N。

          需自備的儀器和用品:

          可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、甲苯(不允許快遞)和蒸餾水。

          試劑的組成和配制:

          提取液:液體60mL×1瓶,4保存;

          試劑一:粉劑×1瓶,臨用前加入9mL蒸餾水,充分溶解待用,4保存;用不完的試劑4保存;

          試劑二:液體22mL×1瓶,4保存;

          試劑三A液:液體×1支,4保存;試劑三B液:液體×1瓶,4保存;臨用前將A液倒入B液中混合,待用;用不完的試劑4保存一周;

          試劑四:液體2mL×1瓶,4保存;

          樣本的前處理

          1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

          細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

          組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

          2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。

          測(cè)定步驟:

          1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至578nm,蒸餾水調(diào)零。

          2、酶促反應(yīng)

          試劑名稱(chēng)

          測(cè)定管

          對(duì)照管

          樣本(μL

          20

          20

          試劑一(μL

          90


          蒸餾水(μL


          90

          試劑二(μL

          190

          190

          混勻,放入37水浴1h后,10000g 25離心10min,取上清液。

          2、將上清液稀釋10倍(取0.1mL上清液,加入0.9mL蒸餾水)。

          3、測(cè)氨量(在微量石英比色皿或96孔板中加入下列試劑)


          測(cè)定管

          對(duì)照管

          稀釋后的上清液(μL

          80

          80

          試劑三(μL

          15

          15

          試劑四(μL

          15

          15

          充分混勻,室溫放置20min

          蒸餾水(μL

          90

          90

          混勻,于578nm處,蒸餾水調(diào)零,讀吸光值A,計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

          UE活力計(jì)算

          a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

          標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.0915x +0.0373;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y吸光值A。

          1、血清(漿)UE活力的計(jì)算:

          單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個(gè)酶活力單位。

          UE活力(μg/min/mL(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷V÷T=27.32×(ΔA -0.0373)

          單位的定義:每天g土樣中產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個(gè)酶活力單位。

          2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中1μg NH3-N活力的計(jì)算:

          1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

          單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個(gè)酶活力單位。

          UE活力(μg/min/mg prot)=(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷(V×Cpr)÷T =27.32×(ΔA -0.0373) ÷Cpr

          2)按樣本鮮重計(jì)算:

          單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個(gè)酶活力單位。

          UE活力(μg/min/ g 鮮重)=(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷(W× V÷V樣總)÷T =27.32×(ΔA -0.0373) ÷W

          3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

          單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個(gè)酶活力單位。

          UE活力(μg/min/104 cell)=(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.0546×ΔA

          10:稀釋倍數(shù);T:反應(yīng)時(shí)間,60min V反總:反應(yīng)體系總體積:0.3mL;V樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mLV樣總:提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量, g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。

          b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

          標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.04575x +0.0373;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y吸光值A。

          1、血清(漿)UE活力的計(jì)算:

          單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個(gè)酶活力單位。

          UE活力(μg/min/mL(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷V÷T=54.64×(ΔA -0.0373)

          單位的定義:每天g土樣中產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個(gè)酶活力單位。

          2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中1μg NH3-N活力的計(jì)算:

          1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

          單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個(gè)酶活力單位。

          UE活力(μg/min/mg prot)=(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷(V×Cpr)÷T =54.64×(ΔA -0.0373) ÷Cpr

          2)按樣本鮮重計(jì)算:

          單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個(gè)酶活力單位。

          UE活力(μg/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷(W× V÷V樣總)÷T =54.64×(ΔA -0.0373) ÷W

          3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

          單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個(gè)酶活力單位。

          UE活力(μg/min/104 cell)=(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.1092×ΔA

          10:稀釋倍數(shù);T:反應(yīng)時(shí)間,60min; V反總:反應(yīng)體系總體積:0.3mL;V樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mL;V樣總:提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量, g500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。


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          優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司

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