谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）試劑盒說明書
微量法 100管/48樣
注 意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
GS（EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物體內氨同化的關鍵酶之一，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺，不僅可以防止過多的銨離子對生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要儲存和運輸形式。
測定原理：
GS在ATP和Mg2+存在下，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺進一步轉化為γ─谷氨?；惲u肟酸，在酸性條件下與鐵形成的絡合物在540nm處有最大吸收峰，可用分光光度計測定。
所需的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：10mL×1瓶，-20℃保存；臨用前37℃預熱20min，充分混勻，如有沉淀，靜置10min，取上清待用。
試劑二：10mL×1瓶，-20℃保存；臨用前37℃預熱20min，充分混勻，如有沉淀，靜置10min，取上清待用。
試劑三：粉劑×2瓶，-20℃保存。用時每瓶加入5mL蒸餾水充分溶解待用。
試劑四：15mL×1瓶，4℃保存。
樣本測定的準備：
1、細菌、細胞或組織樣品的制備：
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至540nm，蒸餾水調零。
2、 在EP管中加入下列試劑：
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 |
試劑一 | 160 | |
試劑二 | 160 | |
試劑三 | 70 | 70 |
樣本 | 70 | 70 |
混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）準確水浴30min
試劑四 | 100 | 100 |
混勻，25℃室溫靜置10min后，8000g，25℃離心10min，取200μL上清液至微量石英比色皿或96孔板中，測定540nm處的吸光值A。△A=A測定管-A對照管。每個測定管需設一個對照管。
GS活力單位的計算：
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線：y = 0.8348x + 0.0008，R2 = 0.9999
1、血清（漿）GS活性
單位定義：每mL血清（漿）在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個酶活力單位。
計算公式：
GS（μmol/h/mL）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷V樣÷T
=10.268×ΔA
2、組織、細菌或細胞GS活性
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個酶活力單位。
GS（μmol/h/mg prot）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
=10.268×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個酶活力單位。
GS（μmol/h/g 鮮重）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T
=10.268×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算
單位定義：每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個酶活力單位。
GS（μmol/h//104 cell）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷T
=0.021×ΔA
V反總：反應體系總體積，0.3mL； V樣：加入樣本體積，0.07mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
標準曲線：y = 0.4174x + 0.0008，R2 = 0.9999
1、血清（漿）GS活性
單位定義：每mL血清（漿）在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個酶活力單位。
計算公式：
GS（μmol/h/mL）=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反總÷V樣÷T
=20.535×ΔA
2、組織、細菌或細胞GS活性
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個酶活力單位。
GS（μmol/h/mg prot）=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
=20.535×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨酰基異羥肟酸定義為一個酶活力單位。
GS（μmol/h/g 鮮重）=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T
=20.535×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算
單位定義：每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個酶活力單位。
GS（μmol/h/104 cell）=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷T
=0.041×ΔA
V反總：反應體系總體積，0.3mL； V樣：加入樣本體積，0.07mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
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