魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒(VNN)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法)
【產(chǎn)品名稱(chēng)】
商品名稱(chēng)：魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒(VNN)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法)
Name ：Viral Nervous Necrosis Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預(yù)期用途】
魚(yú)病毒性神經(jīng)壞死病又稱(chēng)為病毒性腦病和視網(wǎng)膜病，是一種嚴(yán)重危害魚(yú)類(lèi)魚(yú)苗的病毒性疾病。病原為病毒性神經(jīng)壞死病毒（Viral nervous necrosis virus, VNNV）,屬乙型野田村病毒屬成員[1]。其臨床癥狀為一系列與神經(jīng)有關(guān)的異常表現(xiàn)。魚(yú)苗具不正常的螺旋狀或旋轉(zhuǎn)式游動(dòng)或靜止時(shí)腹部朝上，一旦用手觸碰病魚(yú)，病魚(yú)會(huì)立即游動(dòng)等現(xiàn)象，魚(yú)體體色異常蒼白。不同種類(lèi)的魚(yú)臨床癥狀不同，有的魚(yú)苗會(huì)出現(xiàn)鰾過(guò)度膨脹，有的病魚(yú)厭食、消瘦等。發(fā)病嚴(yán)重的魚(yú)苗伴隨著ji高的死亡率[1-2]。
本試劑盒適用于檢測(cè)的魚(yú)的腦、眼等標(biāo)本中魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒 RNA，適用于魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒感染的輔助診斷。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒對(duì)魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒基因設(shè)計(jì)特異性的引物和探針[2-3]，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對(duì)魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。
【試劑組成】
名 稱(chēng) | 規(guī) 格 |
酶液 | 50μL×1 管 |
VNN 反應(yīng)液 | 500μL×2 管 |
VNN 陽(yáng)性質(zhì)控品 | 50μL ×1 管 |
陰性質(zhì)控品 | 250μL ×1 管 |
注：
1） 不同批號(hào)試劑不能混用。
2） 試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次，有效期 12 個(gè)月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列
熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。
【標(biāo)本采集】
取魚(yú)類(lèi)的腦和眼，魚(yú)苗和較小的仔魚(yú)取整條魚(yú)。
【保存和運(yùn)輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)
本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1 樣本前處理
每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱(chēng)取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中， 8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2 RNA 提取
推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），
請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 | VNN 反應(yīng)液 | 酶液 |
用量 | 20μL | 1μL |
將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。
3. 加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的 RNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇：
檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時(shí)間 | 收集熒光信號(hào) |
1 | 1 cycle | 42℃ | 20min | 否 |
2 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
3 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。
5.2 結(jié)果判斷
陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線；
可疑：檢測(cè)通道 35<Ct 值≤38，建議重復(fù)檢測(cè)，如果檢測(cè)通道仍為 35<Ct 值≤ 38，且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線，判定為陽(yáng)性，否則為陰性；
陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>38 或無(wú) Ct 值。
6. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無(wú) Ct 值顯示；
陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
7. 檢測(cè)方法的局限性
? 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
? 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；
? 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；
? 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
? 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
? 試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；
? 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。
【注意事項(xiàng)】
? 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；
? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，wan全混勻并短暫離心；
? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專(zhuān)用工作服；
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；
? 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；
? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全 通則》進(jìn)行處理。
【參考文獻(xiàn)】
[1] 陳愛(ài)平, 江育林, 錢(qián)冬, 等. 病毒性神經(jīng)壞死病[J]. 中國(guó)水產(chǎn), 2010.
[2] 中國(guó)農(nóng)業(yè)部. SC/T 7216-2012 魚(yú)類(lèi)病毒性神經(jīng)壞死病(VNN)診斷技術(shù)規(guī)程[S]. [3]羅衛(wèi). 魚(yú)類(lèi)病毒性神經(jīng)壞死病的病原學(xué)研究及檢測(cè)方法的建立[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.
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