昆蟲線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ（MRCCⅢ）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用。
檢測范圍： 96T
3pg/ml -150pg/ml
使用目的：
本試劑盒用于測定昆蟲樣本中線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ（MRCCⅢ）含量。
實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中昆蟲線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ（MRCCⅢ）水平。用純化的昆蟲線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ（MRCCⅢ）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ（MRCCⅢ），再與HRP標記的線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ（MRCCⅢ）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹di洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ（MRCCⅢ）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中昆蟲線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ（MRCCⅢ）濃度。
試劑盒組成
1 | 30倍濃縮洗滌液 | 20ml×1瓶 | 7 | 終止液 | 6ml×1瓶 |
2 | 酶標試劑 | 6ml×1瓶 | 8 | 標準品（240pg/ml） | 0.5ml×1瓶 |
3 | 酶標包被板 | 12孔×8條 | 9 | 標準品稀釋液 | 1.5ml×1瓶 |
4 | 樣品稀釋液 | 6ml×1瓶 | 10 | 說明書 | 1份 |
5 | 顯色劑A液 | 6ml×1瓶 | 11 | 封板膜 | 2張 |
6 | 顯色劑B液 | 6ml×1/瓶 | 12 | 密封袋 | 1個 |
標本要求
1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
120pg/ml | 5號標準品 | 150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液 |
60pg/ml | 4號標準品 | 150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
30pg/ml | 3號標準品 | 150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
15pg/ml | 2號標準品 | 150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
7.5pg/ml | 1號標準品 | 150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
2. 2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
計算
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復(fù)孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
保存條件及有效期
1．試劑盒保存：2-8℃。
2．有效期：6個月
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