KGN 人卵巢顆粒細(xì)胞瘤細(xì)胞

（Human Ovarian Granulosa Tumor Cells）

KGN 人卵巢顆粒細(xì)胞瘤細(xì)胞

一、T25 細(xì)胞收到后處理

1、觀察

細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至狀態(tài)良好后灌滿完*培養(yǎng)基并密封好瓶口是細(xì)胞運(yùn)輸?shù)淖詈棉k法。收到細(xì)胞后，請(qǐng)

先打開(kāi)外包裝，及時(shí)核對(duì)培養(yǎng)瓶上標(biāo)注的細(xì)胞名稱是否與訂購(gòu)的細(xì)胞名稱一致，并仔細(xì)查看培養(yǎng)瓶是否有

破損或漏液等異常情況，如有破損或漏液等異常情況，請(qǐng)立即拍照，并聯(lián)系工作人員處理。

2、處理

（1）75%酒精棉球擦拭 T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶外部。

（2）待酒精揮發(fā)完*，在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（40x，100x，200x，

各三張）。前三天的細(xì)胞照片為重要的售后依據(jù)，不提供照片默認(rèn)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)良好。

（3）不要打開(kāi)培養(yǎng)瓶蓋，將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中靜置 2-4 小時(shí)后再做處理，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

（4）查看細(xì)胞說(shuō)明書(shū)，按照細(xì)胞說(shuō)明書(shū)中描述的培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)操作（見(jiàn)“細(xì)胞說(shuō)明書(shū)"第一

頁(yè)）。 ? 貼壁細(xì)胞

? 未超過(guò) 80%匯合度時(shí)，將培養(yǎng)瓶中的完*培養(yǎng)基收集至 50mL 離心管中（對(duì)比培養(yǎng)使用），留大約

7mL 完*培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

? 超過(guò) 80%匯合度時(shí)，將培養(yǎng)瓶中的完*培養(yǎng)基收集至 50mL 離心管中（對(duì)比培養(yǎng)使用），根據(jù)情況進(jìn)

行傳代或者凍存，具體操作見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)步驟。首*傳代，建議 1:2 進(jìn)行傳代（分兩個(gè) T25）。傳代時(shí)

建議一瓶用原瓶中的完*培養(yǎng)基，另外一瓶用自行配制的完*培養(yǎng)基，二者進(jìn)行對(duì)比培養(yǎng)。

? 若細(xì)胞貼壁不牢，在運(yùn)輸過(guò)程中容易發(fā)生細(xì)胞脫落，這是正常現(xiàn)象。請(qǐng)將培養(yǎng)瓶中所有培養(yǎng)液收集至

50mL 離心管，1000rpm 離心 5 分鐘，收集上清（對(duì)比培養(yǎng)使用），往細(xì)胞沉淀中加入胰，酶 1-2mL，

輕輕吹打，重懸，消化 1-2 分鐘后，加入 5mL 完*培養(yǎng)基終止消化。1000rpm 離心 5 分鐘，棄去上

清，加入 1-2mL 完*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后按 1:2 的比例進(jìn)行傳代（分兩個(gè) T25），補(bǔ)充完*培養(yǎng)基

至 5-8mL/瓶，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 二、凍存細(xì)胞收到后處理

1、觀察

收到細(xì)胞后，請(qǐng)檢查外包裝情況和箱內(nèi)是否還有干冰。如有外包裝破損、干冰已完*揮發(fā)等問(wèn)題，請(qǐng)立即

拍照，并聯(lián)系工作人員處理。

2、處理

（1）迅速將細(xì)胞取出轉(zhuǎn)移至液氮保存，建議盡早復(fù)蘇。

（2）復(fù)蘇第一管如有細(xì)胞活性問(wèn)題，請(qǐng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（40x，100x，200x，各三張），并及時(shí)

聯(lián)系工作人員處理，后續(xù)會(huì)有技術(shù)人員與您溝通指導(dǎo)后再?gòu)?fù)蘇第二管。特別說(shuō)明：未與我方聯(lián)系擅自復(fù)蘇

第二管，出現(xiàn)問(wèn)題不予售后。

三、細(xì)胞復(fù)蘇

（1）確認(rèn)水浴鍋已升溫至 37℃，取 5mL 預(yù)熱的完*培養(yǎng)基于 15mL 離心管中待用。

（2）從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆面具），快速將其置入 37℃水浴中解凍，直至凍存管中

無(wú)結(jié)晶，然后用 75%的酒精擦拭凍存管外壁。

（3）將凍存管中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含 5mL 完*培養(yǎng)基的 15mL 離心管中，1000rpm 離心 5 分鐘。

（4）棄盡上清，細(xì)胞沉淀用 1-2mL 完*培養(yǎng)基重懸，接種至 T25 培養(yǎng)瓶，補(bǔ)充完*培養(yǎng)基至 5-8mL/瓶，

放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（5）貼壁 5 小時(shí)以上或次日，更換新鮮的完*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 四、細(xì)胞傳代

（1）細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。首先，棄去培養(yǎng)上清，用 PBS 漂洗細(xì)胞 1-2 次。

（2）加入 1-2mL 消化液，置于培養(yǎng)箱中消化適當(dāng)時(shí)間，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部

分變圓并脫落，即消化完*，將細(xì)胞迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入與消化液等體積的含 10%血

清的完*培養(yǎng)基終止消化。

（3）輕輕吹打細(xì)胞，待細(xì)胞完*脫落后轉(zhuǎn)移至 15mL 離心管，1000rpm 離心 5 分鐘。

（4）棄去上清液，然后按推薦比例進(jìn)行分瓶傳代（收到細(xì)胞后首*進(jìn)行傳代，推薦 1:2 比例進(jìn)行分瓶傳

代），補(bǔ)充完*培養(yǎng)基至 5-8mL/瓶。

（5）放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 五、細(xì)胞凍存

（1）細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行細(xì)胞凍存。首先，棄去培養(yǎng)上清，用 PBS 漂洗

細(xì)胞 1-2 次。

（2）加入 1-2mL 消化液，置于培養(yǎng)箱中消化適當(dāng)時(shí)間，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部

分變圓并脫落，即消化完*，將細(xì)胞迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入與消化液等體積的含 10%血

清的完*培養(yǎng)基終止消化。

（3）輕輕吹打細(xì)胞，待細(xì)胞完*脫落后轉(zhuǎn)移至 15mL 離心管，1000rpm 離心 5 分鐘。

（4）棄去上清液，往細(xì)胞沉淀中加入 1mL/支的立譜沃無(wú)血清凍存液（貨號(hào)：PZ110R），混勻后加入凍存

管中，并做好標(biāo)記。

（5）將凍存細(xì)胞直接放入－80℃冰箱即可（如果追求更理想的細(xì)胞復(fù)蘇率，也可選擇使用程序降溫盒），

24 小時(shí)后轉(zhuǎn)入液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存，并做好儲(chǔ)存記錄。