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使用冷凍共聚焦顯微鏡定位活性循環(huán)核孔復(fù)合物（下）
使用共聚焦顯微鏡的三維定位工作流程
在下文中，描述了在3D冷凍共聚焦顯微鏡中識(shí)別熒光目標(biāo)結(jié)構(gòu)的工作流程，以及如何在冷凍FIB-SEM中檢索熒光目標(biāo)結(jié)構(gòu)，目的是以更可靠的方式將其保留在最終FIB薄片中，以便在冷凍TEM中進(jìn)行進(jìn)一步研究。
為了評(píng)估冷凍EM網(wǎng)格和樣本的質(zhì)量，先創(chuàng)建一張相機(jī)概覽圖像。使用透射或反射顯微模式，可以看到載網(wǎng)碳膜是否完整（圖1）。
圖1：EM網(wǎng)格——質(zhì)量評(píng)估和靶分布。以A9細(xì)胞為例。左圖：通過(guò)反射成像觀(guān)察到的網(wǎng)格方格。可見(jiàn)兩個(gè)玻璃化細(xì)胞；在細(xì)胞下方可以觀(guān)察到碳膜上的裂紋。中間圖：透射光下相同的網(wǎng)格方格。其它信息，如冰晶污染，變得可見(jiàn)。右圖：相同細(xì)胞顯示Alexa Fluor 488 Phalloidin以綠色標(biāo)記纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-actin），細(xì)胞核以紅色用DAPI染色。3D成像堆棧的圖像投影。比例尺：10 µm.
同時(shí)，可以判斷有關(guān)細(xì)胞及其相對(duì)于網(wǎng)格方格的位置的信息。在隨后的EM步驟中，只能評(píng)估網(wǎng)格方格中心附近的目的細(xì)胞。為了改善細(xì)胞的定位，可以在將細(xì)胞接種到載網(wǎng)碳膜上之前應(yīng)用微排布技術(shù)[3]。
在下文中，基于未發(fā)表的圖像（德國(guó)海德堡EMBL的Herman Fung和Julia Mahamid提供）和《核孔的在細(xì)胞內(nèi)的原位結(jié)構(gòu)及其轉(zhuǎn)換的快照》中的數(shù)據(jù)[1]，詳細(xì)解釋了3D冷凍靶向過(guò)程。
有關(guān)載網(wǎng)碳膜完整性的信息，以及熒光樣品在網(wǎng)格方格內(nèi)合適的位置，有助于選擇合適的FIB研磨位置（圖2）。
圖2：透射光模式和熒光模式的概覽圖像。具有表達(dá)核孔蛋白Nup159-Atg8-split Venus（紅色）和校準(zhǔn)珠子（紅色，強(qiáng)信號(hào)，圓形，1µm）的酵母細(xì)胞。結(jié)合載網(wǎng)碳膜質(zhì)量信息，可以確定FIB銑削的合適位置。綠色框表示以下步驟中使用的區(qū)域。載網(wǎng)旋轉(zhuǎn)調(diào)整為FIB視圖（見(jiàn)下文）；比例尺：20 µm.
在為FIB銑削選擇相關(guān)位置后，在這些位置沿光軸創(chuàng)建一系列熒光圖像以獲得3D信息。與普通寬場(chǎng)系統(tǒng)相比，要是想提高z方向的分辨率，共聚焦顯微鏡是方法。通過(guò)激光逐點(diǎn)掃描樣品，只記錄熒光發(fā)射的聚焦信息。然后，將在不同z位置記錄的2D圖像組合成3D堆棧（圖3）。
圖3：共焦z堆棧的三維顯示。記錄了與圖2所示相同的網(wǎng)格方格。校準(zhǔn)珠子在綠色和紅色區(qū)域中顯示出強(qiáng)烈的熒光，但仍然可以通過(guò)信號(hào)的強(qiáng)度和形狀進(jìn)行區(qū)分。核孔蛋白Nup159-Atg8-split Venus僅以紅色顯示。后續(xù)FIB銑削的靶位置之一由放大框中的箭頭指示。
顯微鏡系統(tǒng)的軸向分辨率主要取決于所用物鏡的開(kāi)啟角度（所謂的數(shù)值孔徑）。由于商品化冷凍顯微鏡為方便使用者而使用空氣物鏡（不需要浸入，可能會(huì)影響樣品的玻璃化狀態(tài)），因此實(shí)際分辨率有限。xy的典型分辨率為200 nm，z的分辨率約為800 nm。
為了能夠正確定位感興趣的細(xì)胞位置，可以將校準(zhǔn)珠子作為參考結(jié)構(gòu)應(yīng)用于樣品，以便在3D中對(duì)齊和關(guān)聯(lián)熒光和EM圖像[4]。
典型的珠子尺寸為1µm，呈球形，這使其中心坐標(biāo)能夠進(jìn)行亞衍射擬合。通過(guò)SEM中的背散射電子，可以更清晰地觀(guān)察到含有金屬的微珠，從而將它們與大小相似的冰晶區(qū)分開(kāi)來(lái)。優(yōu)先選擇熒光發(fā)射光不同于實(shí)際目標(biāo)結(jié)構(gòu)的熒光發(fā)射光的珠子，以便能夠更好地區(qū)分（圖4）。
圖4：坐標(biāo)變換原理。使用基準(zhǔn)點(diǎn)作為支撐點(diǎn)，將靶坐標(biāo)從光學(xué)顯微鏡轉(zhuǎn)移到FIB-SEM。黃色：校準(zhǔn)珠子；紅色：Nup159-Atg8-split Venus.左圖：共聚焦圖像的投影，圓圈標(biāo)記示例性珠子和箭頭標(biāo)記目標(biāo)NUP。中心圖像：用相同珠子標(biāo)記的SEM圖像。右圖：通過(guò)在兩種模式中疊加珠子信息創(chuàng)建疊加熒光信號(hào)和SEM信號(hào)的圖像。因此，目標(biāo)位置被投射到SEM圖像中。比例尺：20 µm.
由于基準(zhǔn)點(diǎn)在LM和SEM中都可見(jiàn)，因此它們的坐標(biāo)可用于在兩種模式之間轉(zhuǎn)換旋轉(zhuǎn)、平移和縮放等參數(shù)。然后，可以將共聚焦顯微鏡中標(biāo)記的靶坐標(biāo)轉(zhuǎn)換為FIB銑削過(guò)程，以增加獲得FIB薄片中具有感興趣結(jié)構(gòu)的概率。
然而，用于精確3D定位的商業(yè)軟件解決方案尚未開(kāi)發(fā)，但基于上述出版物（3D Correlation Toolbox），有一個(gè)開(kāi)源解決方案可用。
使用3D Correlation Toolbox，可以加載共聚焦圖像數(shù)據(jù)，標(biāo)記靶和校準(zhǔn)珠子，并自動(dòng)確定其中心坐標(biāo)。然后將定義的坐標(biāo)標(biāo)記投射到FIB圖像上，以定義銑削的xyz坐標(biāo)（圖5）。
為了將靶區(qū)域研磨成適當(dāng)薄的體積，感興趣結(jié)構(gòu)的上方和下方各設(shè)定一個(gè)銑削窗口，如熒光信號(hào)投射到FIB圖像上所示（圖5）。然后施加鎵離子束，并削除相應(yīng)窗口中的材料。可以在一個(gè)EM網(wǎng)格上創(chuàng)建多個(gè)薄片，從而提高工作流的效率。
圖5：熒光在FIB圖像上的投影，用于精密銑削。左圖：銑削前樣品的FIB視圖與共聚焦投影的疊加。箭頭表示靶NUP結(jié)構(gòu)。黃色：校準(zhǔn)珠子；紅色：Nup159.Atg8-split-Venus.中心圖像：在關(guān)聯(lián)共焦和FIB圖像之間的珠子位置后，在FIB視圖上疊加共焦圖像平面。箭頭表示下薄片上的靶結(jié)構(gòu)。右圖：研磨后共聚焦圖像投影和SEM視圖的疊加。產(chǎn)生的薄片中含有目標(biāo)結(jié)構(gòu)熒光（見(jiàn)箭頭）。
為了以分子分辨率獲得樣品的結(jié)構(gòu)信息，使用冷凍透射電子顯微鏡對(duì)冷凍樣品薄片進(jìn)行成像。通過(guò)在薄片的SEM和TEM視圖之間進(jìn)行配準(zhǔn)，可以根據(jù)薄片中包含的目標(biāo)熒光信號(hào)確定傾斜序列采集區(qū)域。然后將成像的傾斜序列進(jìn)行計(jì)算組合，以重建細(xì)胞內(nèi)部的三維體積。通過(guò)對(duì)許多同類(lèi)單個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行平均（亞層析平均），可以獲得更好的大分子解析結(jié)構(gòu)。在圖6中，圖5所示的下薄片由冷凍ET成像。斷層照片的分割結(jié)果顯示了核膜與靶NUP位置。
結(jié) 語(yǔ)
本文表明，冷凍共聚焦顯微鏡是冷凍工作流程中的一個(gè)重要組成部分，用于評(píng)估EM載網(wǎng)上玻璃化樣品的質(zhì)量和目標(biāo)結(jié)構(gòu)分布。在冷凍條件下記錄的高分辨率共聚焦數(shù)據(jù)使科學(xué)家能夠在3D熒光下定位感興趣結(jié)構(gòu)。3D體積圖像可作為光電關(guān)聯(lián)的參考，以檢索FIB-SEM中的目標(biāo)結(jié)構(gòu)進(jìn)行銑削，隨后在冷凍TEM中進(jìn)行電子斷層掃描，以獲得目標(biāo)結(jié)構(gòu)在其原生細(xì)胞環(huán)境中的高分辨率圖像。