分色方法
多通道熒光成像的目的是將各種熒光染料發(fā)射的光子收集到獨(dú)立的檢測(cè)通道中。為此，有必要對(duì)全發(fā)射光譜的組分進(jìn)行空間分離，即將這些組分定位到不同的方向。傳統(tǒng)上，這種分離是通過(guò)“次級(jí)二向色鏡"（將照明與發(fā)射分離的主要分光器，稱“主分光器"）進(jìn)行的。出乎意料的是，還可以通過(guò)使用棱鏡或光柵來(lái)分離。根據(jù)光子的顏色對(duì)光子進(jìn)行物理分類，這是一種原始的真彩分色方法。如果主要分色不充分，則可以通過(guò)數(shù)學(xué)分解來(lái)補(bǔ)充。

次級(jí)二向色鏡
自1970年以來(lái)，多通道熒光顯微技術(shù)在生物顯微技術(shù)領(lǐng)域的需求日益增加。在簡(jiǎn)單的情況下，用于單通道設(shè)置的濾光片和二向色鏡在本質(zhì)上允許記錄例如，藍(lán)色或紫外線激發(fā)下的綠色和黃色/橙色熒光（當(dāng)時(shí)被遺忘的標(biāo)準(zhǔn)是富爾根染色，它可以通過(guò)不同的發(fā)射顏色來(lái)辨別和）。寬場(chǎng)顯微技術(shù)通過(guò)使用彩色攝像機(jī)來(lái)達(dá)到這一要求。有時(shí)，特別是對(duì)于定量測(cè)量，圖像被分割，兩個(gè)通道在同一芯片上并行成像。先進(jìn)的是同時(shí)并行使用兩個(gè)或多個(gè)攝像機(jī)。在真共聚焦掃描顯微技術(shù)中，不可能分割感應(yīng)目標(biāo)。因此，通過(guò)添加第二個(gè)（第三個(gè)……）光電倍增管，立即實(shí)現(xiàn)了多通道熒光成像。并行記錄數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)可以直接顯示在屏幕上，例如，在監(jiān)視器的3個(gè)顏色通道中，或以電子方式存儲(chǔ)以供以后分析。要顯示3個(gè)以上的通道，信息必須分布在3個(gè)可用的監(jiān)視器通道中，這不可避免地會(huì)導(dǎo)致分離度和強(qiáng)度分辨率的損失。然而，現(xiàn)代顯微技術(shù)不僅僅能得到清晰的圖像（無(wú)論如何，我們用肉眼只能辨別三個(gè)通道），還可以對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)量。在定量測(cè)量中，只要通道數(shù)量不超過(guò)樣品中熒光染料物質(zhì)的數(shù)量，任何數(shù)量的通道都是有意義的。
 

 
圖1：帶有次級(jí)二向色鏡的4通道共聚焦掃描顯微鏡的布局圖（徠卡 ，1995年）。1和2設(shè)計(jì)為“濾光片輪"，而是固定反射鏡（適用于3通道系統(tǒng)）或固定二向色鏡（適用于4通道系統(tǒng)）。
 
將發(fā)射不同顏色的熒光染料發(fā)射到一組傳感器，最顯而易見(jiàn)的方法是使用二向色鏡。二向色鏡會(huì)反射比二向色原定波長(zhǎng)0更短波長(zhǎng)的光，并能透射更長(zhǎng)波長(zhǎng)的所有顏色的光。這適用于“長(zhǎng)通二向色鏡"。“短通二向色鏡"會(huì)透射較短波長(zhǎng)的光并反射光譜中較紅部分的光。在圖2中，一組三個(gè)次級(jí)二向色鏡1、2和3用于將全光譜分成4個(gè)不同的方向，傳感器隨后可以在其中收集4個(gè)不同的通道。必須根據(jù)所用熒光染料的光譜發(fā)射特性來(lái)選擇次級(jí)二向色鏡。因此，給定的一組次級(jí)二向色鏡可能適合許多發(fā)射方式類似的熒光染料，但如果熒光染料組合的發(fā)射特性顯著不同，則不適用。為解決這一問(wèn)題，使用次級(jí)二向色鏡進(jìn)行分色的系統(tǒng)在每個(gè)分色位置都配備了片輪或滑塊。它們配備了一系列不同的二向色鏡，允許（有限）數(shù)量的不同色帶傳遞給傳感器。顯然，這種解決方案不是很靈活，需要大量的伺服技術(shù)和調(diào)整（預(yù)計(jì)至少保持穩(wěn)定數(shù)月。如果安裝許多激光線，則潛在發(fā)射帶的數(shù)量將會(huì)增加——因此需要的次級(jí)二向色鏡的數(shù)量也會(huì)增加。如果使用白激光，發(fā)射濾光片概念將無(wú)法合理適應(yīng)，只能使用連續(xù)可調(diào)的設(shè)備。圖1表明了1995年次級(jí)二向色概念的實(shí)現(xiàn)。
 

 
圖2：二向色鏡的色散。主分光器將激發(fā)與發(fā)射分離。隨后通過(guò)次級(jí)二向色鏡1、2和3將發(fā)射分成四個(gè)方向（本例）。常規(guī)二向色鏡反射短波長(zhǎng)的光并透射“更紅"顏色的光，盡管相反的特性也同樣可能。
 
 
棱鏡的色散

 
圖3：基于棱鏡的共聚焦檢測(cè)模塊示意圖，該模塊具有可單獨(dú)調(diào)節(jié)波段的5個(gè)通道，用于發(fā)射收集。
1）棱鏡，2）滑塊，3）檢測(cè)器
 
 
 
艾薩克·牛頓爵士在其1704年出版的《光學(xué)》一書中描述了最古老的（有目的的）光分色方法：使用棱鏡。本文的序言部分附有牛頓那本書的插圖。我們?nèi)缃竦慕忉屖?，在不同光學(xué)介質(zhì)的邊界處，較短波長(zhǎng)的光將比較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光的衍射更強(qiáng)（作出一個(gè)簡(jiǎn)單的結(jié)論）。如果將不同顏色混合后（如一組熒光染料組合發(fā)射），穿過(guò)棱鏡，則組合發(fā)射將在光譜上分解。
 
分解強(qiáng)度取決于多個(gè)技術(shù)參數(shù)，但與樣品或傳感器無(wú)關(guān)。這是一個(gè)非常有效和直接的解決方案，可以讓一組熒光染料發(fā)射指向不同方向，這樣就可以記錄下來(lái)。在簡(jiǎn)單的情況下，只需沿著光譜放置一系列檢測(cè)器。這一概念已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了，但在收集效率和靈活性方面還存在嚴(yán)重缺陷。多波段設(shè)備是更好的解決方案，對(duì)每個(gè)要記錄的傳感器，其允許單獨(dú)選擇全光譜的任何部分。
 
棱鏡具有全光譜（平面）透射的優(yōu)勢(shì)，即棱鏡（在原定的光譜范圍內(nèi)）沒(méi)有吸收調(diào)制。透射和色散與偏振方向無(wú)關(guān)。這是一個(gè)重要的定律，因?yàn)闊晒馊玖系陌l(fā)射總是非偏振的。最后但并非最不重要的是，色散僅發(fā)生在一個(gè)方向上——在選擇的階數(shù)中，沒(méi)有其他“階數(shù)"可以降低色散的強(qiáng)度。
 
本文對(duì)色散光譜的線性問(wèn)題進(jìn)行了討論。基于棱鏡的光譜與波長(zhǎng)不呈線性關(guān)系。這對(duì)于技術(shù)設(shè)計(jì)而言不是問(wèn)題，只要不使用線性檢測(cè)器組合，例如多陽(yáng)極光電倍增管或類似設(shè)備。

 
圖4：棱鏡的色散。由于玻璃棱鏡的折射能力取決于衍射光的波長(zhǎng)，因此不同波長(zhǎng)的組合將被分散。在白光的情況下，色散圖案是一個(gè)連續(xù)的光譜。多重標(biāo)記熒光樣品的發(fā)射將產(chǎn)生一個(gè)在熒光染料發(fā)射最大值處具有最大值的光譜。這一技術(shù)是通過(guò)單個(gè)傳感器收集盡可能多的單一染料。
 
 
光柵色散

 
圖5：光柵與棱鏡的效率比較。光柵（藍(lán)色曲線）針對(duì)“閃耀"波長(zhǎng)進(jìn)行了優(yōu)化，該波長(zhǎng)兩側(cè)的效率都會(huì)下降。而且，特定的偏振方向的透過(guò)效率很好（在閃耀時(shí)）。在短波段內(nèi)，垂直偏振顯著下降。棱鏡的效率主要取決于所使用的玻璃類型，并且在長(zhǎng)程范圍內(nèi)是平面且非偏振的（此處：用于可見(jiàn)光發(fā)射的冕玻璃）。
 
 
棱鏡的另一個(gè)色散元件是光柵。透射光柵和反射光柵都在使用。用入射光束照明時(shí)，光柵的周期性結(jié)構(gòu)將使光偏轉(zhuǎn)到不同方向（通過(guò)干涉過(guò)程）。
 
直線方向（0階）不顯示任何色散。通常選擇的方向是一階。在這里，光分散為光譜，非常類似于棱鏡中的色散。然而，還有更多的階數(shù)，如2階和更高階，但在光柵法線的另一側(cè)，也有反射1階……階。光柵制作技術(shù)是將盡可能多的能量集中在一個(gè)單一的階數(shù)中。
 
對(duì)于平行或垂直于線（凹槽）方向的偏振光，光柵的表現(xiàn)也迥然不同。雖然垂直波在最佳情況（取決于各種參數(shù)）下可以產(chǎn)生相當(dāng)有效的光譜，但平行波在距離閃耀波長(zhǎng)兩個(gè)八度范圍內(nèi)顯著下降——大約降為零。由于熒光是非偏振的，因此用垂直效率和平行效率的平均值來(lái)描述總效率。在可見(jiàn)光200 范圍內(nèi)，下降到30%是常見(jiàn)的。
 
對(duì)于效率（光子收集性能）是關(guān)鍵問(wèn)題的儀器而言，這使得光柵成為非常低效且不合適的色散器件——在共聚焦熒光顯微技術(shù)中也是如此。如果該技術(shù)實(shí)現(xiàn)，通常會(huì)附加一系列額外的設(shè)計(jì)元件，試圖引導(dǎo)丟失的光子進(jìn)入傳感器（有時(shí)稱為“光子回收器"）。
 
更復(fù)雜的是，與棱鏡相比，光柵的雜散光損失要大得多。

 
圖6：光柵產(chǎn)生包含入射光束光譜的若干階數(shù)。通過(guò)所用的階數(shù)與入射光束的比值來(lái)計(jì)算絕對(duì)效率。
 
 
色散器的比較
如上文所述，在共聚焦顯微技術(shù)中，熒光發(fā)射色散的各種概念各有優(yōu)缺點(diǎn)。比較概述如下表所示。顯然，棱鏡是完成這項(xiàng)任務(wù)的*。