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        1. 北京佳源偉業(yè)科技有限公司

          如何評(píng)估共聚焦光學(xué)截面厚度

          時(shí)間:2023-5-22 閱讀:576
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          共聚焦顯微鏡用于光學(xué)切片比較厚的樣本。直接的問(wèn)題是:1. 什么是“比較厚的樣本";2. 光學(xué)切片到底有多厚?這兩個(gè)問(wèn)題在一定程度上是相關(guān)的,即假設(shè)一份厚樣本至少比光學(xué)切片厚10倍。

          生物樣本的厚度可以從10米(整只動(dòng)物)到10納米(電子顯微鏡的超薄切片制備)。由于共聚焦顯微鏡采用了入射光的方法,樣本本身的尺寸可能有幾厘米或更多,但表面下方的穿透深度取決于材料的不透明度和物鏡的工作距離。這就限制了樣本大?。▃方向),只能考慮使用厚度多為幾毫米的樣本。

          光學(xué)切片的決定因素是衍射極限。根據(jù)各種不同的參數(shù),共聚焦掃描顯微鏡的真正光學(xué)截面厚度可達(dá)到約0.5毫米。標(biāo)準(zhǔn)共聚焦應(yīng)用(如組織切片)當(dāng)中常用的樣本厚度為50 µm以內(nèi)。



          3D點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)和半高寬(FWHM)
           
          圖1:z方向上強(qiáng)度分布的半高寬(FWHM)用作光學(xué)切片性能的衡量指標(biāo)之一

          點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)通過(guò)足夠小的熒光小球生成,通過(guò)收集xz剖面圖的強(qiáng)度來(lái)加以記錄。上圖顯示了衍射圖中心的強(qiáng)度分布(紅色),并對(duì)50%數(shù)值之間的z方向距離進(jìn)行測(cè)量(介于綠色線段之間)。

          由光學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生的點(diǎn)(光斑)的圖像稱為“點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)"(PSF)。點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)描述了來(lái)自極小光斑的光在三維空間中的分布。這個(gè)衍射模型的中心是一個(gè)橢球形,影響著光學(xué)分辨率。徑向尺寸決定橫向分辨率,軸向尺寸決定聚焦深度,進(jìn)而決定切片性能。

          對(duì)于共聚焦截面切片,其目的在于只傳輸PSF的內(nèi)核部分,即所謂的光學(xué)切片。實(shí)際上,針孔直徑可控制從內(nèi)核外傳遞的光量。因此,處在衍射模型大小范圍內(nèi)的光學(xué)切片很明顯不會(huì)出現(xiàn)類似于面包片的鋒利邊緣,但仍然存在著同等扁平斜率的特征。連接強(qiáng)度曲線兩側(cè)50%強(qiáng)度的z距離稱為“半高寬"(FWHM),而按照慣例,用于測(cè)量光學(xué)切片的厚度。光學(xué)切片的性能通常要通過(guò)聚焦在鏡面上來(lái)進(jìn)行測(cè)量,鏡面用于模擬z方向上無(wú)限薄的結(jié)構(gòu)。這種方法相對(duì)較容易實(shí)現(xiàn)并且可用于檢查共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的性能。從更為現(xiàn)實(shí)的角度進(jìn)行考慮,z切片性能還可以通過(guò)熒光小球進(jìn)行測(cè)量(見(jiàn)圖1)。熒光小球能夠在符合現(xiàn)實(shí)中熒光成像非相干條件下進(jìn)行性能測(cè)量,因此滿足了生物醫(yī)學(xué)科學(xué)中的大多數(shù)共聚焦應(yīng)用。反射光模式(鏡面)中受衍射限制的光學(xué)切片與熒光模式的切片相比要薄得多。在比較文獻(xiàn)中的圖表時(shí)請(qǐng)務(wù)必牢記這一點(diǎn)。
           
          控制光學(xué)切片厚度的參數(shù)

          在理想條件下,可實(shí)現(xiàn)的切片厚度僅取決于光學(xué)衍射的限制。

          影響大的是波長(zhǎng),主要按比例控制PSF的大?。翰ㄩL(zhǎng)越短,切片越薄。我們可以假設(shè)激發(fā)光的波長(zhǎng)有限(而不是發(fā)射光的波長(zhǎng)),因?yàn)檎彰鲄^(qū)域外并無(wú)發(fā)射光。

          第二個(gè)參數(shù)是物鏡的光圈(數(shù)值孔徑,NA):NA越高(信息收集的角度越寬),則光學(xué)切片越薄。此外,樣本的折射率會(huì)影響軸向分辨率,進(jìn)而影響到切片性能。圖2給出了切片尺寸與這些參數(shù)的相互關(guān)系。

          第三個(gè)參數(shù)是探測(cè)路徑中的針孔直徑,對(duì)于上面給出的公式可假設(shè)其為零。因此,該公式給出了熒光成像的值,當(dāng)然這只具有理論意義:直徑為零的針孔不會(huì)生成明亮的圖像!


          圖2:熒光樣本中光學(xué)切片受衍射限制的小厚度。針孔直徑假設(shè)為零。真正共聚焦掃描系統(tǒng)中的半高寬(FWHM)。

          光學(xué)切片厚度的評(píng)估關(guān)鍵

          數(shù)值孔徑NA對(duì)切片厚度有顯著影響。PSF的徑向擴(kuò)展與NA成線性關(guān)系。因此,對(duì)于低NA物鏡,PSF內(nèi)核會(huì)拉得極長(zhǎng),而且切片會(huì)變得很厚。因此,絕大多數(shù)應(yīng)用中都是用NA>1的浸潤(rùn)式物鏡,其中xy和z維度的比例大致接近于2倍。按照經(jīng)驗(yàn),高NA物鏡z部分分辨率大致為xy的兩倍。

          理論上的考慮有助于評(píng)估光學(xué)系統(tǒng)的性能。實(shí)際上,儀器和樣本都會(huì)導(dǎo)致計(jì)算數(shù)值的偏差。必須仔細(xì)校準(zhǔn)并操作儀器才能獲得性能。而樣本本身就是分辨率的敵人,尤其是在更深層次成像時(shí)。
          因此,必須特別注意折射率匹配、適宜和恒定的溫度以及正確的蓋玻片選擇。該理論給出的是經(jīng)驗(yàn)法則,但樣本和設(shè)置可能會(huì)帶來(lái)顯著的偏差——因?yàn)樯飿颖颈染w(或真空)更復(fù)雜,所以偏差通常也不可避免。
           
          參考文獻(xiàn)
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