激光顯微鏡的優(yōu)勢
激光顯微鏡與傳統(tǒng)寬場顯微鏡相比,具有高清晰度、高分辨率、高靈敏度等特點,在生物醫(yī)學領(lǐng)域應用廣泛,成為了該領(lǐng)域重要的成像工具。為什么共聚焦能得到如此多的寵愛,它又有哪些優(yōu)勢呢?本文列舉了三方面來論述共聚焦的優(yōu)勢。
只收集焦平面上的信號,使圖像由模糊變清晰
樣品比較厚的時候,普通寬場熒光顯微鏡只能夠觀察到整體的樣品結(jié)構(gòu),而共聚焦顯微鏡卻可以展現(xiàn)樣品輪廓及內(nèi)部結(jié)構(gòu)。
那么共聚焦顯微鏡是如何實現(xiàn)這一優(yōu)勢的呢?這就要歸功于共聚焦的關(guān)鍵硬件—針孔(pinhole),如圖二所示,它是檢測器前面的一個小孔,放置在與樣品焦面共軛的光學平面上。當激發(fā)光照射樣品時,焦面和非焦平面上的樣品區(qū)域都會被激發(fā)而產(chǎn)生熒光信號,調(diào)節(jié)合適的針孔大小(通常為1 Au),使焦面上的熒光信號(綠色虛線)可以通過針孔到達檢測器,而非焦平面的熒光信號(紅色和藍色虛線)不能通過針孔到達檢測器。通過增加硬件針孔,使共聚焦在不改變普通熒光顯微鏡的制片方法的前提下,得到了清晰的高質(zhì)量圖像。
可連續(xù)獲取不同焦平面的信號,實現(xiàn)三維重組
由于針孔的存在,我們能夠只獲取到焦平面上的信號,得到高分辨率的二維圖像。連續(xù)調(diào)節(jié)Z軸位置,就能夠得到不同Z軸位置的二維圖像,獲得一系列連續(xù)的“光學切片"圖像。獲得這些光學切片后,可使用儀器軟件配備的3D模塊進行三維圖像的重組,構(gòu)建出清晰的3D圖像。這種無損傷的、連續(xù)的光學切片圖像的采集,實現(xiàn)了“細胞CT"的功能。
應用于共定位(Co-localization)研究
共定位結(jié)果的精準度與圖像的分辨率密切相關(guān),所以我們在進行共定位實驗時需要選擇更高分辨率的成像方式。共聚焦顯微鏡相比于傳統(tǒng)顯微鏡以其高分辨率的優(yōu)勢,成為共定位研究的得力工具。
由于衍射極限的存在,激光顯微鏡常規(guī)共聚焦光學分辨率在200nm左右,當我們需要觀察大于200nm的結(jié)構(gòu)時,共聚焦就能夠準確判斷其共定位程度。如果需要進行共定位分析,可以選用共聚焦軟件中配備的共定位分析模塊。