前不久，為了應(yīng)對細胞外囊泡（EV）領(lǐng)域快速發(fā)展的挑戰(zhàn)和機遇，逐步完善和統(tǒng)一EV的定義、制備、表征以及功能研究分析等的行業(yè)觀點和準(zhǔn)則，國際細胞外囊泡學(xué)會（ISEV）發(fā)布了最新的《MISEV》（細胞外囊泡研究的最少信息指南）。MISEV2023匯編了來自ISEV專家組和全球1051名研究人員的反饋，為研究學(xué)者提供了最新的研究方法和指導(dǎo)原則，推動EVs和外泌體領(lǐng)域更快更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)匕l(fā)展。
作為正交方法驗證光學(xué)表征技術(shù)
正交實驗方法是研究多因素多水平試驗的一種常用設(shè)計方法，也就是當(dāng)確定關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)的參數(shù)時，推薦采用兩種或兩種以上不同原理的方法檢測同一指標(biāo)。由于許多EV表征方法不是特定適用于EV的，或者無法檢測所有的EV，而檢測同一表征參數(shù)的正交方法（不止一種原理的方法）不太可能具有相同的偏差，因此使用多種不同原理的表征方法對EV 樣本進行分析，互為正交，互相驗證，可以更加確保發(fā)表的EV數(shù)據(jù)的可靠性和可重復(fù)性。
MISEV2023第一次將RPS技術(shù)作為與基于流式的方法（包括基于微珠的流式和單EV流式）和基于顯微鏡的方法（包括原子力顯微鏡、電鏡、DLS、NTA、超分辨顯微鏡等）并列推薦的常用EV顆粒表征方法。RPS方法作為電學(xué)原理的技術(shù)，也是常用EV粒徑和濃度表征中僅有一個“非光學(xué)"原理的檢測手段，可以很好地同其他光學(xué)原理方法（如電鏡、NTA、原子力顯微鏡、納米流式等）形成正交，彼此驗證，從而保障和體現(xiàn)數(shù)據(jù)地嚴(yán)謹(jǐn)性。NanoCoulter作為RPS設(shè)備中的優(yōu)秀者，已在多家外泌體企事業(yè)單位、藥品監(jiān)管機構(gòu)和國家計量單位中進行過全面驗證，并得到大家的可信賴數(shù)據(jù)（粒徑、濃度檢測精確度CV%< 5%，準(zhǔn)確度回收率< ±3%，n≧ 10）。
較寬的粒徑LOD范圍，適用于各種EVs
并且，每一份樣本檢測報告均出具LOD范圍內(nèi)的粒徑分布直方圖，同時也展示樣本的平均粒徑、集中粒徑、中位粒徑以及寬度系數(shù) (Span) 等綜合統(tǒng)計指標(biāo)。
極寬的濃度LOD區(qū)間，三個數(shù)量級的線性相關(guān)
MISEV2023建議在發(fā)表或公布某個樣本的濃度數(shù)據(jù)時，同時附上濃度定量所采用的檢測方法，以及該方法在包含所示樣本濃度的某個濃度區(qū)間中，連續(xù)稀釋樣本的濃度線性關(guān)系數(shù)據(jù)。這一方面，NanoCouler憑借先進的絕對定量原理，以及精確的濃度檢測穩(wěn)定性，一經(jīng)推出市場便獲得廣大用戶的青睞。NanoCouler的濃度LOD（檢測限）為5x107- 2x1011 particles/mL，同時即使是濃度的LOQ（定量限，R2> 0.999）都可以在跨三個數(shù)量級（108- 1010 particles/mL，如下圖）范圍中保持良好的線性相關(guān)。
建議必要的樣本檢測前處理程序
粒徑檢測的高靈敏度（單顆粒粒徑）和高分辨率（< 1 nm） 是RPS技術(shù)的明顯優(yōu)勢。而與此同時由于納米孔芯片的設(shè)置，存在較大顆粒的復(fù)雜樣本（如未經(jīng)純化的細胞培養(yǎng)上清）也就很容易發(fā)生堵塞，因此MISEV建議使用離心或過濾等分析前步驟來去除較大顆粒，同時延長納米孔壽命。同時應(yīng)明確說明任何分析前處理程序，以便這些方法更合理地同正交方法進行比較。根據(jù)參考文獻，推薦用戶采用以下超離或超濾步驟：
【超速離心法 (UC)】
方法一：取100-150 mL新鮮或解凍的細胞懸液或尿液，使用超速離心機固定角度轉(zhuǎn)子（k-factor 131，最大加速和最大減速），或4 mL血漿樣本（k-factor 131，最大加速和最大減速）在4°C下以120,000 g離心2 h。在第一次離心后，用PBS重懸EV顆粒，隨后在4°C繼續(xù)以120,000 g在同一管中進行第二次離心2 h。除去上清液后，將EV樣本收集重懸于100 µL PBS中 [2]。（也建議預(yù)先將細胞培養(yǎng)基樣本以2000 g離心兩次，每次10 min，用以去除細胞或較大的細胞碎片，之后用0.45 µm的濾膜過濾后再進行超離提純，效果更佳）
方法二：分離細胞系EV時，當(dāng)貼壁細胞融合度達70%以上時，收集細胞培養(yǎng)基。2000 g離心10 min，去除細胞和較大碎片。將樣本10,000 g離心1 h，之后經(jīng)0.45 µm的濾膜過濾，再100,000 g離心1.5 h后，將EV樣本收集重懸于100 µL PBS中 [3]。
【體積排阻色譜 (SEC) 與超濾】
空白緩沖液對照為設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)操作流程
MISEV2023在NTA和RPS技術(shù)要求中均提出建議“將空白緩沖液的對照納入檢測流程，來識別檢測背景"。而NanoCoulter恰恰在設(shè)計之初就在每個單次樣本的檢測前，在程序的標(biāo)準(zhǔn)操作流程中設(shè)置了空白緩沖液（或稀釋液）的對照（如下圖紅框），即每一次檢測待測樣本前，程序上必須先以空白緩沖液上樣檢測，并確認(rèn)檢測電信號基線以及排除潛在的殘余雜質(zhì)風(fēng)險。并且，瑞芯智造團隊在設(shè)備標(biāo)配緩沖液中加入微量表面活性劑（不影響囊泡），從而幫助顆粒樣本的分散?？瞻讓φ盏脑O(shè)置，幫助用戶嚴(yán)謹(jǐn)實驗，確定空白背景是否存在干擾的同時，亦增加了芯片耗材的利用頻次，極大程度地可重復(fù)使用，降低檢測成本。
經(jīng)Triton X-100處理，EV顆粒數(shù)目明顯下降，該樣品純度= (1-破膜后/破膜前) *100% = 87.2%。
不斷創(chuàng)新優(yōu)化的設(shè)備功能
NanoCoulter系列納米庫爾特單顆粒分析設(shè)備問世之后，也在不斷汲取客戶建議反饋的同時，進行著持續(xù)地軟硬件革新與完善。目前軟件已升級至v3.2版本（產(chǎn)品說明詳細展示了設(shè)備及軟件細節(jié)），且將會繼續(xù)保持以季度為單位的軟件更新頻率，并承諾向廣大用戶提供免費升級與技術(shù)支持服務(wù)，助力細胞外囊泡等納米顆粒領(lǐng)域的研究不斷發(fā)展。
1、Welsh JA, Goberdhan DCI, O'Driscoll L, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 2024;13(2)
2、Dong L, Zieren RC, Horie K, et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. J Extracell Vesicles. 2020;10(2)
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