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l 細(xì)胞鑒定

STR鑒定已通過

l 細(xì)胞來源

國家資源庫

l 細(xì)胞背景

該細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)SV40大T抗原，并且促進(jìn)最適病毒產(chǎn)物的產(chǎn)生。

l 細(xì)胞特性

1.來源：胚腎

2.形態(tài)：圓形，貼壁生長+懸浮生長

3.含量：>1x106  細(xì)胞數(shù)

4.規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5.用途：僅供科研使用。

l 培養(yǎng)條件：

1）準(zhǔn)備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

l 注意事項：

1. 細(xì)胞復(fù)蘇或傳代后會有少部分的細(xì)胞貼壁和部分懸浮的細(xì)胞，復(fù)蘇兩天后細(xì)胞會從貼壁細(xì)胞向外開始生長，有時細(xì)胞再生長過程中，細(xì)胞會再貼壁細(xì)胞的上方生長，形成不同的細(xì)胞層，這種情況會有發(fā)生。 在細(xì)胞復(fù)蘇的一周內(nèi)，培養(yǎng)瓶中 通常會有懸浮的活的細(xì)胞團(tuán)，在換液過程中不要丟棄在這些活的懸浮細(xì)胞，可以通過離心（125×g）回收細(xì)胞，重新打回到培養(yǎng)瓶中，分離或者丟棄漂浮的活細(xì)胞會使細(xì)胞數(shù)量變少，引起細(xì)胞的停滯生長或細(xì)胞死亡。

2.培養(yǎng)條件的細(xì)微變化，尤其是pH和培養(yǎng)基中血清的質(zhì)量，可能會影響細(xì)胞的生長狀況，在細(xì)胞的生長過程中會有細(xì)胞內(nèi)的液泡出現(xiàn)，特別在細(xì)胞快要融合是會出現(xiàn)這種情況。培養(yǎng)細(xì)胞時使用未被滅活的高質(zhì)量、低內(nèi)毒素的胎牛血清，可以使細(xì)胞更好的貼壁和形成單層細(xì)胞。

3. 細(xì)胞在生長過程中可以通過將血清濃度提到到20%來改善細(xì)胞生長緩慢的情況。（參考atcc 有關(guān)該細(xì)胞的描述）

l 細(xì)胞培養(yǎng)：

1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL*培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml*培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)70%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

該細(xì)胞為輕微貼壁和少量懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，傳代可以參考以下方法：

1. 收集：將培養(yǎng)瓶中的懸浮的細(xì)胞收集到離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。由于細(xì)胞貼壁不牢PBS潤洗后細(xì)胞會脫落所以PBS也要回收到離心管中。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3. 將收集到的懸浮細(xì)胞、pbs清洗液中的細(xì)胞和消化下來的貼壁細(xì)胞以1000rpml離心5min，棄去上清，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的*培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3） 細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實驗使用。下面T25瓶為例；

1.細(xì)胞凍存時按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細(xì)胞/ml.

2.1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細(xì)胞/ml分配到一個凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3.將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

l 運輸形式：

低溫：（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

常溫（2） T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

l 生物安全

1. 所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏，并會慢慢充滿液氮。解凍時，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚的碎屑造成人員傷害。