細(xì)胞一般儲存在液氮中,溫度達(dá)196°C ,理論上儲存時間是無限的。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融,實驗證明這樣可以zuida限度的
保存細(xì)胞活力。
細(xì)胞復(fù)蘇就是要把原本冷凍保存(凍存)著的細(xì)胞恢復(fù)到一般的生長狀態(tài),今天我們來看看原代細(xì)胞的復(fù)蘇步驟。
一、檢查
收到細(xì)胞株包裹時,請檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形,若有請立即處理告訴寄方。細(xì)胞株請盡速開始培養(yǎng), 或立即冷凍保存(置于-70
。C ,隔夜后,移到iq N2)。
二、冷凍細(xì)胞解凍
1、依據(jù)細(xì)胞株說明書zhiding的基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、血清種類和其它zhiding之成份和比例,制備培養(yǎng)基。
絕大多數(shù)之細(xì)胞均無法立即適應(yīng)不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同的血清種類,若因?qū)嶒炐枰?必須有所不同時,務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組
成，確定細(xì)胞適應(yīng)后,方進(jìn)行所需之實驗。
2、FBS (fetal bovine serum,胎牛血清), CS (calfserum,小牛血清)和HS (horseserum,馬血清) ,對細(xì)胞而言差異jida,請務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株
資料zhiding的血清種類培養(yǎng)細(xì)胞。
3、將培養(yǎng)基置于37 °C水槽中回溫,回溫后噴以70 %酒精并擦拭之,移入無菌操作臺內(nèi)。取出冷凍管，立即放入37 °C水槽中快速解凍,
水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿,否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化后,以70 % ethanol擦拭冷凍管外部,移入無菌
操作臺內(nèi)。
4、依據(jù)細(xì)胞種類和濃度,于無菌操作臺內(nèi)取10 ml培養(yǎng)基加至T25或T75 flask中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液,緩緩加入T25或T75 flask內(nèi)
之培養(yǎng)基,混合均勻,放入37°C , 5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
5、對絕大多數(shù)細(xì)胞而言, 1 %以下之冷凍保護(hù)劑DMSO ,不會對細(xì)胞之貼附或活化有不良影響,不需立刻由解凍細(xì)胞中去除,待第二二天確
定細(xì)胞生長或貼附良好后再去除即可。
對極少數(shù)因?qū)MSO敏感或會造成細(xì)胞分化之細(xì)胞,需立即去除DMSO者,則可將解凍后之細(xì)胞懸浮液放入5- 10 ml培養(yǎng)基中,離心300
xg (約1000 rpm) , 5分鐘,小心移去上清液,加入適量新鮮培養(yǎng)基,將細(xì)胞均勻混合后,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,再放入37°C, 5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)
三、收到T25 flask細(xì)胞時的處理方式
1.于寄送過程中,為避免起泡造成細(xì)胞脫落死亡, T25 flask均加滿培養(yǎng)基。請檢查flask 外觀,并于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況和有無污染
現(xiàn)象，若有任何問題,不要打開蓋子,請立即通知細(xì)胞實驗室。
2.將原封之T25 flask 靜置于37。C，5 % CO2培養(yǎng)箱中,使細(xì)胞回溫至37。C , 并讓運(yùn)送過程中少數(shù)脫落的細(xì)胞可再附著生長。
隔天后,于無菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基, (取出之培養(yǎng)基可以再使用) ,僅留約5-10ml培養(yǎng)基于flask內(nèi),依-般培養(yǎng)方式再將細(xì)胞置
入培養(yǎng)箱中,或細(xì)胞已長滿盤,則將細(xì)胞做傳代培養(yǎng)。
四,細(xì)胞復(fù)蘇注意事項
1、整個復(fù)蘇過程盡量手腳麻利-些,戰(zhàn)線拉得太長可能影響復(fù)蘇效果;
2、由于“化冰”這一步里凍存管與水溫差太大,尤其是液氮里來的凍存管,放到水里可能會造成翻江倒海的既視感,所以可以用鑷子夾住
凍存管往水里摁,這樣即使有炸裂的情況也會有水做緩沖;
3、取凍存管時要謹(jǐn)防凍傷,尤其是夏天,盡管熱也zuihao穿長袖白大褂, -些不經(jīng)意的動作可能會把你的小鮮肉“粘”到冰箱門上;
4、離心這-步也可以在凍存管里的冰融化后直接進(jìn)行,也就是直接把凍存管離心,離心后棄去原來的凍存液,然后直接加*培養(yǎng)基重懸
細(xì)胞,接著把細(xì)胞轉(zhuǎn)到培養(yǎng)皿/瓶里培養(yǎng)。這種方法也許不能將DMSO清除得很干凈,但是基本影響不大。
5、復(fù)蘇第二天記得去看看細(xì)胞 ,如果狀態(tài)還不錯的話就說明復(fù)蘇成功
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