超濾法制備外泌體 | Amicon® Ultra超濾管應(yīng)用方案

時間：2023/11/15閱讀：558

默克Amicon^®Ultra 超濾管采用低蛋白吸附的Ultracel^®再生纖維素超濾膜，確保更精準(zhǔn)的截留分子量和更高的蛋白回收率。因其優(yōu)異的性能，Amicon^®Ultra 超濾管已被廣泛應(yīng)用于多種樣品制備的場景，包括蛋白/抗體/酶/核酸等生物樣本的濃縮、脫鹽和緩沖液置換、病毒/噬菌體/外泌體/囊泡/微粒等樣本的純化、藥物篩選、藥物結(jié)合實驗、蛋白富集、小分子物質(zhì)去除、分析樣品前處理等，為科學(xué)研究提供高效的創(chuàng)新方案。

外泌小體（Exosome）是一種囊泡結(jié)構(gòu)，直徑通常在30-150nm，常見于正常體液和病理樣本，培養(yǎng)細(xì)胞也可分泌。研究人員已經(jīng)在血液、唾液、尿液、母乳等中發(fā)現(xiàn)外泌小體，其運(yùn)載的蛋白和核酸涉及其細(xì)胞間物資、信息交流，影響和調(diào)控著多方面的生理功能，包括腫瘤發(fā)生、免疫促進(jìn)、凋亡調(diào)控、血管生成、炎癥反應(yīng)及發(fā)育和分化等。由于在體液中出現(xiàn)，外泌小體對于臨床生物標(biāo)志物檢測特別有利，成為體外診斷、biomarker研究的新熱點(diǎn)。

之前我們有文章介紹通過PS（磷酯酰絲氨酸）親和法提取外泌體，今天給大家介紹另外一種提取外泌體的方法——超濾法。說到超濾，那就不得不提默克的超濾管了，默克Amicon^®Ultra 系列超濾管相信大家基本都有所了解，很多老師應(yīng)該都有用過。

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超濾法提取外泌體

兩步法細(xì)胞上清的外泌體分離

操作步驟：從細(xì)胞培養(yǎng)上清中制備外泌體

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步驟01

樣品澄清

1、將培養(yǎng)基上清從培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)移到50ml錐形管中；

2、旋緊Steriflip^®組件（貨號:SCGP00525，0.22µm，PES膜）至樣品管頂部，打開樣品管末端；

3、倒置組件并固定在基座或架子上；

4、將調(diào)節(jié)真空源連接到Steriflip^®裝置側(cè)面的真空端口上。打開真空使溶液通過膜進(jìn)入空管；

5、拆下Steriflip^®裝置并蓋上樣品。將過濾后的樣品保存在4°C或進(jìn)行囊泡富集。

本離心超濾方案基于使用AU-15超濾管（10kDa MWCO，#UFC901024）處理15mL樣品。如果要使用不同的體積或超濾管規(guī)格（AU-0.5，AU -2或AU-4mL），請參閱相應(yīng)的Amicon^®Ultra超濾管使用說明書。

步驟02

超濾管平衡

1、向超濾管中加入2ml PBS，蓋上蓋子，在4,000xg的擺桶轉(zhuǎn)子中離心10分鐘；

• 對于AU-2和AU-4，可以使用相同的離心機(jī)轉(zhuǎn)速。如果要使用固定角度轉(zhuǎn)子，請查閱設(shè)備用戶指南以獲得適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速和體積限制。
• 對于AU-0.5，樣品在可容納1.5mL管的固定轉(zhuǎn)子中以14,000xg離心。

2、移去超濾裝置底部未過濾的PBS，抽取收集管里的濾液。

• 對于AU-2、AU-4和AU-15，可通過移液器去除濾液。
• 對于AU-0.5，可1000 x g 反轉(zhuǎn)離心2分鐘去除濾液，移除收集管中PBS或更換新的收集管。

步驟03

樣品超濾

1、像AU-15超濾管中加入15ml樣品，蓋上蓋子；

2、 4,000xg離心30分鐘；

備注：終產(chǎn)品體積通常大約500µL（30倍濃度），但根據(jù)樣品的性質(zhì)、流速和離心時間可能會有所不同。有關(guān)樣品體積和終體積的估計，請參閱對應(yīng)Amicon^®Ultra超濾管使用說明書。

3、從離心機(jī)上取下超濾裝置，棄除收集管里的液體；

4、往過濾裝置中加入14mL PBS，移液器輕輕吸吐多次。4,000xg離心30分鐘；
5、從過濾裝置中回收濃縮樣品；
• 對于AU-2、AU-4和AU-15，可用移液器吸取樣品，并多次沖洗膜側(cè)壁（每側(cè)3-4次）以確?；厥铡?br/>• 對于AU-0.5，將過濾器倒扣在干凈的離心管中。在2000xg下離心1分鐘，將樣品轉(zhuǎn)移到試管（反向旋轉(zhuǎn)）。

6、細(xì)胞外囊泡樣品準(zhǔn)備好進(jìn)行分析。

注意事項及補(bǔ)充提示：

• 無血清樣品選擇3kDa孔徑是為了盡可能提高外泌體的回收率；
• 有血清樣品選擇100kDa/500kDa孔徑是為了盡可能去除細(xì)胞分泌蛋白以及血清成分中小于外泌體的白蛋白造成的影響；
• 研究者可根據(jù)樣品的粘稠程度，以及需要制備的目標(biāo)外泌體/囊泡/顆粒的大小分布來選擇和優(yōu)化超濾孔徑（3kDa/10kDa/30kDa/50kDa/100kDa），以便達(dá)到更好的得率和操作體驗；
• 樣品體積大于30mL時可以考慮用超濾杯或Centricon plus -70超濾管，請注意攪拌式超濾杯在200mL以內(nèi)時吸附損耗可能較離心式超濾管略偏高；
• 如需進(jìn)一步提高特定外泌體的純度，可選用包被相應(yīng)抗體的磁珠進(jìn)行親和純化精制。

超濾法制備的外泌小體參考數(shù)據(jù)

多維度分析4個SH-SY-5Y細(xì)胞系的外泌小體樣品（含或不含血清）：