葡萄糖脫氫酶（GCDH）活性檢測(cè)試劑盒(紫外分光光度法)

注意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1248

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

GCDH（EC 1.1.1.47）催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H，主要存在于多種微生物和高等動(dòng)物的肝臟中。GCDH是一種制備高含量低聚果糖的理想用酶，同時(shí)也是臨床血糖測(cè)定的診斷用酶，可廣泛用于食品工業(yè)及醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域中。

GCDH 催化D-葡萄糖和NAD生成D-葡萄糖酸和NADH，利用NADH在340 nm處吸光值的變化即可反映葡萄糖脫氫酶的活性。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體60 mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體50 mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入15mL試劑一溶解，用不完的試劑4℃保存。

試劑三：粉劑×2瓶，-20℃避光保存。臨用前每瓶加入5mL試劑一溶解，用不完的試劑建議分裝后-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式低溫離心機(jī)、水浴鍋、1 mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提?。?/span>

組織：按照組織質(zhì)量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后，8000 g，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測(cè)。

細(xì)胞或細(xì)菌：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）︰提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌（功率20%或200 W，超聲3s，間隔7s，總時(shí)間5min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

血漿（清）：直接檢測(cè)。

二、測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液的配制：按照試劑一︰試劑二︰試劑三為4︰3︰2的體積比例充分混勻，備用，用前37℃預(yù)熱10 min。

3、 操作表：在1mL石英比色皿中分別加入下列試劑：

三、GCDH 酶活計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol 的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GCDH 酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=1607.7×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每克樣品每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GCDH 酶活（U/g 鮮重）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T =1607.7×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌和細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GCDH 酶活（U/10⁴cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)））÷T

=1607.7×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

（4）按液體體積計(jì)算

酶活定義：每mL樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GCDH 酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷V樣÷T=1607.7×ΔA

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/ mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)， 1mol=10⁹ nmol；V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V樣總： 加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g，T：反應(yīng)時(shí)間：1min。

注意事項(xiàng)：

1、樣本提取上清液置于冰上待測(cè)，且樣本提取完成后建議當(dāng)天提取當(dāng)天內(nèi)測(cè)完。

2、當(dāng)A1或A2大于1時(shí)，建議將樣品用提取液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

3、當(dāng)ΔA大于1時(shí)，建議將樣品用提取液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。