乳酸含量（LA）檢測試劑盒（微量法）

產(chǎn)品貨號：BA1259

產(chǎn)品規(guī)格：100管/48樣

產(chǎn)品簡介：

乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產(chǎn)物，與糖代謝、脂類代謝、蛋白質(zhì)代謝及細(xì)胞內(nèi)能量代謝密切相關(guān)，乳酸含量是評估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標(biāo)。乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸，同時使NAD⁺還原生成NADH和H⁺，H⁺傳遞給PMS生成的PMSH₂還原MTT生成紫色物質(zhì)，在570nm處有特征吸收峰。

技術(shù)指標(biāo)：

檢出限：0.0771μmol/mL

線性范圍：0.078-5μmol/mL

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進(jìn)行檢測。

產(chǎn)品組成：

溶液的配制：

1. 試劑二：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管中。臨用前按試劑二（V）：蒸餾水（V）=10μL：450μL的比例配制試劑二溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；

2. 試劑三：臨用前加入4mL蒸餾水充分溶解，可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融，-20℃保存一周；

3. 試劑四：臨用前加4mL蒸餾水充分溶解，4℃保存一周；

4. 試劑五：臨用前每瓶加入3mL蒸餾水混勻，可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融，-20℃保存一周；

5. 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入1.04mL蒸餾水配成100μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；

6. 顯色液的配制：臨用前根據(jù)用量按照試劑三（V）：試劑四（V）=1：1的比例充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

需自備的儀器和用品： 

天平、研缽/勻漿器、離心機(jī)、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、乙醇和蒸餾 水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再加入0.15mL提取液二，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再加入0.15mL提取液二，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

3. 血清（漿）：取100μL血清（漿）加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再加入0.15mL提取液二，12000g離心10min后取上清待測。

二、測定步驟 

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，波長調(diào)至570nm，分光光度計用乙醇調(diào)零。

2. 標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：將100μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋為2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液待測。

3. 加樣表：

三、乳酸含量的計算

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1. 以各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸，以其對應(yīng)的吸光值（ΔA標(biāo)準(zhǔn)）為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b，將ΔA測定帶入公式中得到x（μmol/mL）。

2. 乳酸含量計算

（1）按照樣本蛋白濃度計算

LA含量（μmol/mg prot）=x×V樣本÷（V樣本×Cpr）=x÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

LA含量（μmol/g質(zhì)量）=x×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷W

（3）按照細(xì)胞數(shù)量計算

LA含量（μmol/10⁶ cell）=x×（V上清+V提取液二）÷（5×V上清÷V提取液一）=0.2375×x

（4）按照液體體積計算

LA含量（μmol/mL）=x×（V上清+V提取液二）÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）]=13.0625×x

V樣本：加入的樣本體積，0.01mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定；V上清：提取時上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入提取液二的體積，0.15mL；V提取液一：加入的提

取液一體積，1mL；5：細(xì)胞數(shù)量，5×10⁶個；V液體：液體樣本體積，0.1mL。

注意事項(xiàng):

如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進(jìn)行測定。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例： 

1. 取0.1g兔心加入1mL提取液一進(jìn)行勻漿研磨離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后稀釋5倍，之后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定管=A測定-A對照=0.591-0.069=0.522，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 y=0.412x-0.0214，x=1.319，按樣本質(zhì)量計算含量得：

LA含量（μmol/g質(zhì)量）=1.1875×x÷W×稀釋倍數(shù)=1.1875×1.319÷0.1×5=78.32μmol/g質(zhì)量。

2. 取100μL小鼠血清加入1mL提取液一，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清，之后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定管=A測定-A對照=0.572-0.211=0.361，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.412x-0.0214，x=0.928，按照液體體積計算含量得：

LA含量（μmol/mL）=13.0625×x=13.0625×0.928=12.122μmol/mL。

相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

[1]  Meixi Peng,Dan Yang,Yixuan Hou,et al.Intracellular citrate accumulation by oxidized ATM-mediated metabolism reprogramming via PFKP and CS enhances hypoxic breast cancer cell invasion and metastasis. Cell Death and Disease. March 2019;(IF5.959)

[2] Xiaojin Luo,Weihua Shi，Haoming Yu,et al. Wearable Carbon Nanotube-Based BioSensors on Gloves for Lactate. Sensors. October 2018;(IF3.031)

[3] Zhou F, Du J, Wang J. Albendazole inhibits HIF-1α-dependent glycolysis and VEGF expression in non-small cell lung cancer cells[J]. Molecular and cellular biochemistry, 2017, 428(1-2): 171-178.

參考文獻(xiàn)：

Eolbergrová J, MacMillan V, Siesj? B K. The effect of moderate and marked hypercapnia upon the energy state and upon the cytoplasmic NADH/NAD⁺ ratio of the rat brain[J]. Journal of neurochemistry, 1972, 19(11): 2497-2505.