β-半乳糖苷酶（β-GAL）活性檢測試劑盒（可見分光光度法）

產(chǎn)品貨號：BA1029

產(chǎn)品規(guī)格：50管/24樣

產(chǎn)品內(nèi)容：

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前每瓶加入5mL雙蒸水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：5μmol/mL的對硝基苯酚溶液。

產(chǎn)品說明：

β-GAL(EC 3.2.1.23)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，能夠催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷鍵水解，此外還具有轉(zhuǎn)半乳糖苷的作用。β-GAL不僅可為植物的快速生長釋放儲存的能量，還能在正常的多糖代謝、細(xì)胞壁組分代謝以及衰老時細(xì)胞壁降解過程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖殘基的水解，釋放自由的半乳糖。

β-GAL分解對-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算β-GAL活性。

注意：實(shí)驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

二、測定步驟： 

1. 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至400nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 標(biāo)準(zhǔn)液的處理：用蒸餾水將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL。

3. 樣本測定（在EP管中依次加入下列試劑）：

三、β-GAL活性計算： 

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度（x，減去濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)管OD值）和濃度（y，nmol/ml）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線， 將△A帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算樣品生成的產(chǎn)物量（nmol/ml）。

2. β-GAL活性計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GAL活力(nmol/h /mg prot)=(y×V反總)÷(V樣×Cpr)÷T

=20×y÷Cpr

蛋白濃度需要另外測定。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GAL活力(nmol/h /g鮮重)＝(y×V反總)÷(W×V樣÷V樣總)÷T

 =20×y ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GAL活力(nmol/h /10⁴ cell)= (y×V反總)÷(500×V樣÷V樣總)÷T

 =0.04×y

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.5mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬；T：反應(yīng)時間，0.5h。