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        1. 上海尚寶生物科技有限公司
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          400-611-0007

          α-淀粉酶活性檢測試劑盒 (碘-淀粉比色法) (微量法)使用說明書

          時(shí)間:2023/8/25閱讀:253
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          α-淀粉酶活性檢測試劑盒 (-淀粉比色法) (微量法)

          產(chǎn)品貨號:BA1928

           

          產(chǎn)品規(guī)格:100T/48S

           

          產(chǎn)品簡介:

          淀粉酶負(fù)責(zé)水解淀粉,包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)可隨機(jī)地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷鍵, 生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖,同時(shí)使淀粉的粘度降低,因此又稱為液化酶。

          α-淀粉酶催化淀粉分子中的α-1,4糖苷鍵水解,產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖以及糊精等,碘可以與未被水解的淀粉結(jié) 合,生成在570nm下有特征吸收峰的復(fù)合物,其深淺可計(jì)算出淀粉酶的活力單位。

          α-AL耐熱,但是β-淀粉酶可在 70℃鈍化15min。因此粗酶液經(jīng)過70℃鈍化15min,就只有α-AL能夠催化淀粉水解。

           

          注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

           

          產(chǎn)品組成:

          試劑名稱

          規(guī)格

          保存條件

          試劑一

          粉劑×1

          2-8

          試劑二

          液體10mL×1

          2-8

          試劑三

          液體30mL×1

          2-8

          標(biāo)準(zhǔn)品

          粉劑×1

          2-8

          溶液的配制:

          1. 試劑一:臨用前加入6.25mL試劑三,置于常溫水中并加熱至煮沸,期間不斷攪拌粉劑至溶解,用不完的試劑2-8℃保存8周;

          2. 標(biāo)準(zhǔn)品:10mg淀粉標(biāo)準(zhǔn)品。臨用前加10mL試劑三,置沸水浴中振蕩溶解,配成1mg/mL淀粉標(biāo)準(zhǔn)液,2-8℃保存四周。

           

          需自備的儀器和用品:

          酶標(biāo)儀/可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板/微量玻璃比色皿、研缽/勻漿器、 蒸餾水。 

           

          操作步驟:

          一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))

          1. 組織:稱取約0.1g樣本,加1mL蒸餾水勻漿;勻漿后在室溫下放置提取15min,每隔5min振蕩1次,使其充分提取;6000g,室溫離心10min,吸取上清液即為淀粉酶原液。

          2. 液體:直接檢測。(若有渾濁則離心后進(jìn)行測定)

          二、測定步驟

          1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長到570nm,分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

          2. 將淀粉標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

           

          序號

          稀釋前濃度(mg/mL

          標(biāo)準(zhǔn)液體積(µL

          稀釋后濃度(mg/mL

          稀釋后濃mg/mL

          1

          1

          200

          300

          0.4

          2

          0.4

          200

          200

          0.2

          3

          0.2

          200

          200

          0.1

          4

          0.1

          200

          200

          0.05

          5

          0.05

          200

          200

          0.025

          6

          0.025

          200

          200

          0.0125

          7

          0.0125

          200

          200

          0.00625

          3. 實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需100µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

          4. 按操作表依次加入各試劑:

          試劑(μL

          測定管

          對照管

          空白管

          標(biāo)準(zhǔn)管

          標(biāo)準(zhǔn)空白管

          α-淀粉酶原液

          100

          100

          -

          -

          -

          蒸餾水

          -

          -

          100

          -

          100

          標(biāo)準(zhǔn)溶液

          -

          -

          -

          100

          -

          70℃水浴15min左右,冷卻

          試劑一

          100

          -

          100

          -

          -

          蒸餾水

          -

          100

          -

          100

          100


          試劑二

          50

          50

          50

          50

          50

          混勻后吸取200μL于微量玻璃比色皿或者96孔板中讀取測定管、對照管、空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管570nm的吸光度,分別記為A測定、A對照、A空白、A標(biāo)準(zhǔn)和A標(biāo)準(zhǔn)空白,計(jì)算ΔA測定=A空白-A測定-A對照),ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A標(biāo)準(zhǔn)空白。標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)空白管只需做1-2次。

          三、α-淀粉酶活性計(jì)算

          1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

          根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度(x,mg/mL)和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)(y,ΔA標(biāo)準(zhǔn)),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,將ΔA測定(y,ΔA測定)帶入公式計(jì)算樣本濃度(x,mg/mL)。

          2. α-淀粉酶活性計(jì)算

          (1)按照樣本質(zhì)量計(jì)算

          單位定義:每g組織每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個(gè)酶活力單位。

          α-淀粉酶活性 (U/g 質(zhì)量)=x×V÷(W×V÷V樣總)÷T=0.1×x÷W

          (2)按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算

          單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個(gè)酶活性單位。

          α-淀粉酶活性 (U/mg prot)= x×V÷V×Cpr÷T=0.1×x÷Cpr

          (3)按照液體體積計(jì)算

          單位定義:每mL液體每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個(gè)酶活性單位。

          α-淀粉酶活性 (U/mL)= x×V÷V÷T=0.1×x

          V樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.1mLV樣總:樣本總體積,1mLCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W: 樣本質(zhì)量,gT:反應(yīng)時(shí)間,10min。

           

          注意事項(xiàng):

          1. 吸光值大于1.5或者ΔA大于0.8時(shí),可以對樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后測定。

           

           

           


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