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α-淀粉酶活性檢測試劑盒 (碘-淀粉比色法) (微量法)
產(chǎn)品貨號:BA1928
產(chǎn)品規(guī)格:100T/48S
產(chǎn)品簡介:
淀粉酶負(fù)責(zé)水解淀粉,包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)可隨機(jī)地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷鍵, 生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖,同時(shí)使淀粉的粘度降低,因此又稱為液化酶。
α-淀粉酶催化淀粉分子中的α-1,4糖苷鍵水解,產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖以及糊精等,碘可以與未被水解的淀粉結(jié) 合,生成在570nm下有特征吸收峰的復(fù)合物,其深淺可計(jì)算出淀粉酶的活力單位。
α-AL耐熱,但是β-淀粉酶可在 70℃鈍化15min。因此粗酶液經(jīng)過70℃鈍化15min,就只有α-AL能夠催化淀粉水解。
注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
產(chǎn)品組成:
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
試劑一 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃ |
試劑二 | 液體10mL×1瓶 | 2-8℃ |
試劑三 | 液體30mL×1瓶 | 2-8℃ |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃ |
溶液的配制:
1. 試劑一:臨用前加入6.25mL試劑三,置于常溫水中并加熱至煮沸,期間不斷攪拌粉劑至溶解,用不完的試劑2-8℃保存8周;
2. 標(biāo)準(zhǔn)品:10mg淀粉標(biāo)準(zhǔn)品。臨用前加10mL試劑三,置沸水浴中振蕩溶解,配成1mg/mL淀粉標(biāo)準(zhǔn)液,2-8℃保存四周。
需自備的儀器和用品:
酶標(biāo)儀/可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板/微量玻璃比色皿、研缽/勻漿器、 蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))
1. 組織:稱取約0.1g樣本,加1mL蒸餾水勻漿;勻漿后在室溫下放置提取15min,每隔5min振蕩1次,使其充分提取;6000g,室溫離心10min,吸取上清液即為淀粉酶原液。
2. 液體:直接檢測。(若有渾濁則離心后進(jìn)行測定)
二、測定步驟
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長到570nm,分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。
2. 將淀粉標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
序號 | 稀釋前濃度(mg/mL) | 標(biāo)準(zhǔn)液體積(µL) | 稀釋后濃度(mg/mL) | 稀釋后濃度(mg/mL) |
1 | 1 | 200 | 300 | 0.4 |
2 | 0.4 | 200 | 200 | 0.2 |
3 | 0.2 | 200 | 200 | 0.1 |
4 | 0.1 | 200 | 200 | 0.05 |
5 | 0.05 | 200 | 200 | 0.025 |
6 | 0.025 | 200 | 200 | 0.0125 |
7 | 0.0125 | 200 | 200 | 0.00625 |
3. 實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需100µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。
4. 按操作表依次加入各試劑:
試劑(μL) | 測定管 | 對照管 | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 標(biāo)準(zhǔn)空白管 |
α-淀粉酶原液 | 100 | 100 | - | - | - |
蒸餾水 | - | - | 100 | - | 100 |
標(biāo)準(zhǔn)溶液 | - | - | - | 100 | - |
70℃水浴15min左右,冷卻 | |||||
試劑一 | 100 | - | 100 | - | - |
蒸餾水 | - | 100 | - | 100 | 100 |
試劑二 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
混勻后吸取200μL于微量玻璃比色皿或者96孔板中讀取測定管、對照管、空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管570nm下的吸光度,分別記為A測定、A對照、A空白、A標(biāo)準(zhǔn)和A標(biāo)準(zhǔn)空白,計(jì)算ΔA測定=A空白-(A測定-A對照),ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A標(biāo)準(zhǔn)空白。標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)空白管只需做1-2次。 |
三、α-淀粉酶活性計(jì)算
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度(x,mg/mL)和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)(y,ΔA標(biāo)準(zhǔn)),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,將ΔA測定(y,ΔA測定)帶入公式計(jì)算樣本濃度(x,mg/mL)。
2. α-淀粉酶活性計(jì)算
(1)按照樣本質(zhì)量計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個(gè)酶活力單位。
α-淀粉酶活性 (U/g 質(zhì)量)=x×V樣÷(W×V樣÷V樣總)÷T=0.1×x÷W
(2)按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個(gè)酶活性單位。
α-淀粉酶活性 (U/mg prot)= x×V樣÷(V樣×Cpr)÷T=0.1×x÷Cpr
(3)按照液體體積計(jì)算
單位定義:每mL液體每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個(gè)酶活性單位。
α-淀粉酶活性 (U/mL)= x×V樣÷V樣÷T=0.1×x
V樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.1mL;V樣總:樣本總體積,1mL; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W: 樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間,10min。
注意事項(xiàng):
1. 吸光值大于1.5或者ΔA大于0.8時(shí),可以對樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后測定。
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