4-香豆酸：輔酶A連接酶（4CL）活性檢測試劑盒（微量法）

產(chǎn)品貨號：BA1006

產(chǎn)品規(guī)格：100管/96樣

產(chǎn)品簡介

4-香豆酸：輔酶A連接酶（4-coumarate:CoA ligase，4CL）是木質(zhì)素生物合成的關(guān)鍵酶之一，主要催化肉桂酸及其羥基或者甲氧基衍生物生成相應(yīng)的輔酶A酯，這些中間產(chǎn)物隨后進(jìn)入苯丙類衍生物支路合成途徑。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機理，為減少水果石細(xì)胞含量而提高其品質(zhì)提供依據(jù)。

4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA，其在333nm下測有特征吸收峰，測定4-香豆酸CoA的生成速率，即可反應(yīng)4CL活性。

產(chǎn)品內(nèi)容： 

溶液的配制：

1. 提取液：內(nèi)含不溶物，使用前搖勻；

2. 試劑二：臨用前加入3mL蒸餾水溶解，可以分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；

3. 試劑四：臨用前用4mL蒸餾水溶解備用，可以分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；

4. 試劑五：加入1mL蒸餾水溶解，臨用前用蒸餾水稀釋40倍后備用，現(xiàn)用現(xiàn)配；

5. 工作液的配制：按體積比將試劑二：試劑三：試劑四：試劑五=1:1:1:1的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟（僅供參考）：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

二、測定步驟

1. 紫外分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至333nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 操作表（在0.5mL EP管中進(jìn)行下列操作）：

三、4CL活計算 

A、按微量石英比色皿計算： 

1. 按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位。

4CL（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹ ]÷(V樣×Cpr) ÷T

=15.87×ΔA÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計算：

單位定義：每g組織每分鐘生成1nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位。

4CL（U/g質(zhì)量）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹ ]÷(W×V樣÷V樣總) ÷T

=15.87×ΔA÷W

3. 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算：

單位定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位。

4CL（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹ ]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

=0.03174×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：4-香豆酸輔酶A摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，30min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

B、按96孔UV板計算： 

將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔UV板光徑）進(jìn)行計算即可。

注意事項：

1. 若ΔA大于0.5，將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測定。

2. 建議一次測定不要測定過多樣本以免耽誤過多的酶促反應(yīng)時間。

3. 空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔，正常情況下，變化不超過0.01。