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分光光度計的工作原理
分光光度計要測量的樣品必須是均一的溶液,不能有沉淀,如果有沉淀的話就要搖勻。之于為什么這樣做和可以做哪些測量、如何測量,下面詳述: 分光光度計就是利用分光光度法對物質(zhì)進行定量定性分析的儀器。 而分光光度法則是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度,對該物質(zhì)進行定性和定量分析。 常用的波長范圍為:(1)200~400nm的紫外光區(qū),(2)400~760nm的可見光區(qū),(3)2.5~25μm(按波數(shù)計為4000cm<-1>~400cm<-1>)的紅外光區(qū)。所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計(或比色計)、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精密度和準確度,所有儀器應按照國家計量檢定規(guī)程或本附錄規(guī)定,定期進行校正檢定。 單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時,被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光路長度)成正比,其關系如下式: 1 A=log — =ECL T 式中 A 為吸收度; T 為透光率; E 為吸收系數(shù),采用的表示方法是(E1% 1cm),即吸收度換算成溶液濃度為1%(g/ml),液層厚度為1cm的數(shù)值; C 為100ml溶液中所含被測物質(zhì)的重量,g(按干燥品或無水物計算); L 為液層厚度 ,cm。 物質(zhì)對光的選擇性吸收波長,以及相應的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后,可用同樣條件將該供試品配成溶液,測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū),除某些物質(zhì)對光有吸收外,很多物質(zhì)本身并沒有吸收,但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多,且常使用單色光純度較差的儀器,故測定時應用標準品或?qū)φ掌吠瑫r操作。 分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。 分光光度計的簡單原理 分光光度計計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源,通過系列分光裝置,從而產(chǎn)生特定波長的光源,光源透過測試的樣品后,部分光源被吸收,計算樣品的吸光值,從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。