菌種的管理與操作技術(shù)

菌（毒）種的管理與操作技術(shù)

中國藥品生物制品檢定所 王國治 中國疾病預防控制中心 王秋娣（感謝王老師的科學研究，致敬！）

摘要：菌（毒）種及樣品的運輸、保管、在實驗中的應用與操作，是生物安全實驗室（微生物實驗室）安全管理的重要方面，為保證實驗室安全和實驗操作者免受其害，本文論述了菌（毒）種的管理和監(jiān)督系統(tǒng)文件制定、微生物操作技術(shù)規(guī)范、避免感染性物質(zhì)進入人體的的措施和對意外事故的處理方法。

關(guān)鍵詞：生物安全實驗室，菌（毒）種管理，微生物操作技術(shù)，事故處理

保證生物安全實驗室（微生物實驗室）安全，對菌（毒）種及樣品的運輸、保藏、使用等方面的管理是重要內(nèi)容之一。如何建立和執(zhí)行有效的管理與監(jiān)督制度、標準操作規(guī)程和實驗室操作技術(shù)規(guī)范是該類實驗室的重中之重。菌（毒）種的管理包括樣品的運輸、保藏、使用等方面的內(nèi)容，而對管理而言則是保證生物安全實驗室安全（包括微生物實驗室）的重要內(nèi)容之一。然而，菌（毒）種的管理應建立規(guī)范和嚴格的管理制度以及對該制度的有效監(jiān)督，才能真正地防止在傳染病防治、科學研究以及生物制品生產(chǎn)過程中造成菌（毒）種的擴散或遺失，同時可避免發(fā)生實驗室感染或由其引起的相關(guān)傳染病的傳播事件；而規(guī)范的菌（毒）種的管理又可避免菌種在使用過程中發(fā)生不應出現(xiàn)的差錯，同時保證菌毒種保藏的質(zhì)量以確保試驗結(jié)果的可靠性。

在日常的實際工作中可以發(fā)現(xiàn)：大多數(shù)的實驗室將“傳代過程"與“數(shù)量"合并于研究記錄中的現(xiàn)象，或者是存在著記錄的不完整性，而記錄不正確的現(xiàn)象更是較為普遍。我們可以設(shè)想，如果在這一過程中缺少真正直接反應實際工作狀況、獨立的傳代與銷毀記錄，將來則難以追蹤培養(yǎng)物的去向，這會不利于研究單位的安全自查和上級有關(guān)單位的核查，那么嚴格的督察也只能是形式上的監(jiān)督作用，而事實上卻無法真正確保生物安全實驗室的安全。因此，要求生物安全實驗室應根據(jù)所從事的實際工作性質(zhì)來制定獨立的菌（毒）種保藏、開啟、傳代至銷毀的原始記錄，其中，記錄的內(nèi)容應包括傳代菌（毒）種來源、傳代時間、傳代數(shù)量、傳代用途以及備注等；銷毀記錄應包括銷毀方式、銷毀物品明細表（培養(yǎng)物、實驗用具等）、滅菌溫度與時間（開始時間，達到溫度時間，停止滅菌時間，取出時間）。當然，實驗記錄同時應有實驗人與復核人并記錄在案。另則，實驗室負責人應對記錄內(nèi)容負責，上級主管檢查人員以及國家督察人員應將該項

目作為重點檢查的內(nèi)容之一，并對整個檢查過程進行認真而負責的督察，不應疏忽任何的點滴，嚴格地按照規(guī)范的管理制度執(zhí)行，防止事故發(fā)生，為本單位和國家把好質(zhì)量關(guān)和安全關(guān)。

一、菌(毒）種管理與監(jiān)督系統(tǒng)的文件制定

為保證菌（毒）種管理體系能規(guī)范化制度化的正常運作，可以通過制定符合本單位實際情況的菌（毒）種管理及監(jiān)督標準操作規(guī)范（SOP）也是非常必要的，該（SOP）主要內(nèi)容包括：菌（毒）種管理與監(jiān)督標準操作細則，其內(nèi)容應包括：菌（毒）種接收（分離）標準操作細則（SOP）；種子批制備與質(zhì)控標準操作細則（SOP）；菌（毒）種使用、保藏、分發(fā)標準操作細則（SOP）；菌（毒）種銷毀標準操作細則（SOP）；菌（毒）種事故應急處理的標準操作細則（SOP）：菌（毒）種管理監(jiān)督的標準操作細則（SOP）。而對應于各個細則可根據(jù)所研究的實際內(nèi)容或?qū)嶒炓?，制定更為詳細的每一種實驗的獨立操作細則，并為其設(shè)計相對應的規(guī)范化表格化的原始記錄。以備日后各種驗證和檢查所需。

（一）菌（毒）種管理與監(jiān)督標準操作細則對于總則的內(nèi)容要包括菌（毒）種管理與監(jiān)督的制定SOP的指導思想、各種實驗內(nèi)容SOP的形成與批準程序、主要內(nèi)容提要以及全部SOP的目錄、實施與監(jiān)督。

1、菌（毒）種接收（分離）標準操作細則

菌（毒）種接收標準操作細則（SOP）要求內(nèi)容包括:

① 接收(外購、贈送)審批與接收程序;

② 菌（毒）種來源、背景資料、接收樣品檢驗的要求有原始記錄:

③ 菌（毒）種外購(接受贈送)申請表；

④ 菌種來源,背景資料登記記錄菌（毒）種入庫登記表；

⑤ 外來菌種傳代與檢驗記錄菌（毒）種分離標準操作細則（SOP）取樣程序;對菌種的來源,其背景資料的要求、樣品的分離操作(如分離過程比較復雜的可分別書寫各自獨立的SOP)

2、菌（毒）種種子批制備與質(zhì)控標準操作細則（SOP）。菌（毒）種種子批制備標準的操作細則（SOP）的內(nèi)容應包括：

① 原代主代及工作種子批制備過程的各種工藝要求細則;

② 批準種子批發(fā)行使用程序,各過程還應制定相對應的實驗原始記錄。 需要注意的是：菌（毒）種種子批質(zhì)控標準操作細則（SOP）應根據(jù)各菌（毒）

種的不同特性,制定相關(guān)的形態(tài)學、血清學、生化特性、免疫原性、純菌或外源因子檢查、核酸序列分析等檢定方法與結(jié)果判定。這要求在各個過程中都應制定相對應的實驗原始記錄并保存在檔。針對各項檢定項目應制定相對應實驗原始記錄，并有檢定結(jié)果的匯總表，種子批申請放行使用申請表與審批表等。

3、菌（毒）種使用、分發(fā)與保藏標準操作細則（SOP）。菌（毒）種使用、分發(fā)程序、菌（毒）種保藏方法的建立及驗證，菌（毒種的備份制度、菌（毒）種定期穩(wěn)定性檢查制度。

①菌（毒）種出、入庫登記表

②菌（毒）種使用申請表

③菌（毒）種保藏方法驗證記錄

④菌（毒）種定期穩(wěn)定性檢查記錄

4、菌（毒）種滅活與銷毀標準操作細則（SOP）。該標準操作細則應由菌（毒）種銷毀申報審批程序、銷毀菌（毒）種復核程序、銷毀菌（毒）種滅活驗證方案等組成。還應具備表格等的配套記錄。①菌（毒）種銷毀申報表

②菌（毒）種滅活與銷毀記錄

③銷毀菌（毒）種滅活驗證試驗記錄

5、菌（毒）種事故應急處理標準操作細則（SOP）。各相關(guān)使用單位應建立發(fā)生菌（毒）種丟失、破損或?qū)嶒炇野l(fā)事故的應急處理辦法等標準操作細則。①菌（毒）種備份制度②事故申報表及相關(guān)處理記錄等報告6、菌（毒）種管理監(jiān)督標準操作細則（SOP）。應要求各單位的生物安全部門必須重視菌（毒）種的管理監(jiān)督事項，定期了解本單位的菌（毒）種保管、檢定及使用情況的相關(guān)規(guī)定，并進行人員抽查考核制度，有效預防事故的發(fā)生。需建立以下記錄與表格等文件化的監(jiān)督標準。①制定現(xiàn)場抽查記錄（表）

②制定人員考核記錄（表）

③樣品來源,背景資料登記記錄

④菌(毒)種分離記錄

⑤外來菌種傳代與檢驗記錄

⑥菌（毒）種入庫或處理登記表

二、生物安全實驗室微生物操作技術(shù)規(guī)范

在實驗室內(nèi)標本的操作:包括其采集、內(nèi)部運輸、接收和打開標本的方法正確與否，都會增加或造成相關(guān)人員發(fā)生實驗室感染的危險性。因此，在進行感染性標本的操作時應注意以下問題：

（一）樣品容器 樣品容器的材料可以是玻璃的，但建議最好使用塑料制品為宜。樣品容器本身要求堅固，并正確地用蓋子或塞子蓋好后應檢查是否無泄漏。在容器外部不能有殘留物。容器上應當正確地粘貼標簽以便于識別。樣品的要求或說明書不能卷在容器外面，而是要分開放置，最好能放置在防水的袋子里。樣品在設(shè)施內(nèi)的傳遞為了避免意外泄漏或溢出，應當使用盒子等二級容器，并將其固定在架子上使裝有樣品的容器保持直立狀態(tài)。二級容器可以是金屬或塑料制品，但應該可以耐高壓滅菌或耐受化學消毒劑的要求。密封口最好有一個墊圈并要求定期地清除污染。

（二）樣品接收 需要接收大量樣品的實驗室應當具備專門的房間或空間。實驗室事故、傷害以及與工作有關(guān)的實驗室感染主要是由于人為失誤、不良實驗技術(shù)以及儀器使用不當而造成的，當實驗室樣品的收集以及內(nèi)部傳遞和接收不當時，都能夠帶來相關(guān)人員感染的危險。應建立完善的管理制度與操作細則，避免或盡量減少這類問題或事故的發(fā)生。

（三）包裝開啟

作為接收和打開樣品的工作人員應當了解樣品對身體健康的潛在危害的知情權(quán)，要了解并接受過如何采用常規(guī)預防措施的培訓，特別是處理破碎或泄漏的容器時更應如此。樣品的開啟要在生物安全柜內(nèi)進行，并準備好消毒劑。

（四）移液管和移液輔助器的使用

1、應使用移液輔助器，嚴禁用口吸取

2、所有移液管應帶有棉塞以減少移液器具的污染

3、不能向含有感染性物質(zhì)的溶液中吹氣

4、感染性物質(zhì)不能夠用移液管反復吹吸混合

5、不能將液體從移液管內(nèi)用力吹出

6、刻度對應(Mark—to—mark)移液管不需要吹出最后一滴液體的比較安全，因此最好使用這種移液管，以避免發(fā)生不必要的事故。

7、污染的移液管應該*浸泡在盛有適當消毒液的防碎容器中。使用后的移液管應當在消毒劑中浸泡18或24小時后再進行處理。

8、盛放廢棄移液管的容器應當放在生物安全柜內(nèi)，直至高壓滅菌后方能放置在外面。

9、固定有皮下注射針頭的注射器不能夠用于移液。應當用鈍頭導管替代針頭使用。可以用工具打開瓶塞后再用移液管取樣，從而避免使用注射器和針頭。

10、為了避免感染性物質(zhì)從移液管中意外滴出而擴散，在工作臺面應當放置一塊浸有消毒液的無紡布或吸有消毒液的紙，使用后將其高壓滅菌或按感染性廢物進行處理。

（五）避免感染性物質(zhì)擴散的措施：1、在實驗操作過程中為避免轉(zhuǎn)移物質(zhì)灑落，微生物接種環(huán)的直徑應為2—3mm并*封閉，手柄的長度應小于6cm以減小振動?；蛘卟捎靡淮涡詼缇藓?。2、使用封閉式微型電加熱器消毒接種環(huán)應避免在本生燈的明火上加熱，否則容易引起感染性物質(zhì)的爆濺。最好使用不需要進行再消毒的一次性接種環(huán)。3、為了避免產(chǎn)生氣泡和氣溶膠的擴散，不要在玻片上進行觸酶試驗，而應當采用試管、毛細管或蓋玻片法。4、準備高壓滅菌和或處理的廢棄樣品和培養(yǎng)物應當放置在防漏的容器內(nèi)，如實驗室廢物袋。

5、在每一階段的實驗工作結(jié)束后，必須采用適當?shù)南緞┣宄ぷ鲄^(qū)域的污染。

（六）生物安全柜的使用

當出現(xiàn)溢出、破損或不良操作時，安全柜就將不再具備能保護操作者的功能應參考國家標準和相關(guān)文獻，正確掌握生物安全柜的使用方法和了解其局限性。并應當建有書面的操作步驟、安全操作手冊等，在使用中應注意以下事項：1、生物安全柜必須運行正常時才能使用。2、生物安全柜在使用中不能打開玻璃觀察擋板。3、安全柜內(nèi)應僅放置本次實驗所需的器材或樣品，否則將阻礙后部的氣流循環(huán)。樣品在放人安全柜內(nèi)的工作區(qū)前需要清除表面污染。4、安全柜內(nèi)不能使用酒精燈，否則因燃燒而產(chǎn)生的熱量會干擾柜內(nèi)氣流并有可能將過濾器燒壞，致使過濾器損壞。允許使用微型電加熱器，但建議最好使用一次性無菌接種環(huán)。5、所有工作必須在工作臺面的中后部進行，并能夠通過觀察擋板觀看到。6、盡量減少操作者身后的人員流動，以免影響安全柜的氣流。7、操作者不應反復移出和伸進手臂以免干擾氣流。8、實驗記錄、移液管以及其他物品不能夠阻礙前面的空氣格柵，因為這將干擾氣體流動，引起物品的潛在污染和操作者的暴露。9、

工作完成后以及每天下班前，應使用適當?shù)南緞ι锇踩竦谋砻孢M行擦拭。10、工作開始前和結(jié)束后，安全柜的風機應至少運行5分鐘。

三、避免感染性物質(zhì)注入人體

（一）針頭注射：1、通過認真練習和仔細操作，可以避免破碎玻璃器皿的意外刺傷。但建議在實驗室盡可能的用塑料制品代替玻璃制品。2、皮下注射針頭、玻璃吸管以及破碎的玻璃均可能將感染性物質(zhì)注入體內(nèi)。3、以下兩點可以減少針刺事故： (a)注射時特別小心；(b)減少使用注射器和針頭；（c）許多操作可用帶有鈍頭導管的注射器替代。也可用一些簡單的裝置來打開瓶塞，然后使用吸管取樣。4、不要重新給用過的針頭戴護套。一次性注射器用完后，不必將針頭從注射器上取下，應丟棄在防穿透的帶蓋容器中。5、應當用塑料吸管代替玻璃吸管。

（二）血清的分離：1、只有經(jīng)過嚴格培訓的人員才能進行這項工作。2、操作時應戴手套以及眼睛和黏膜的保護裝置。3、規(guī)范的實驗操作技術(shù)可以避免或盡量減少噴濺和氣溶膠的產(chǎn)生。血液和血清應當小心吸取，而不能傾倒。嚴禁用口吸液。4、移液管使用后應*浸入次氯酸鹽或其他適當?shù)南疽褐?。移液管應在消毒液中浸泡至?8小時，然后再丟棄或滅菌清洗后重復使用。5、帶有血凝塊等的廢棄樣品管，在加蓋后應當放在適當?shù)姆缆┤萜鲀?nèi)高壓滅菌和或焚燒。

6、為了清洗噴濺和溢出的血樣，應當備有每天新鮮配制的次氯酸鹽溶液。

四、意外事故的處理

（一）菌（毒）外溢在臺面、地面和其他表面時的處理

1、戴手套，穿防護服，必要時需進行臉和眼睛防護。

2、用布或紙巾覆蓋并吸收溢出物。

3、向紙巾上傾倒適當?shù)南緞?，并立即覆蓋周圍區(qū)域。通?？梢允褂?%漂白劑溶液（次氯酸鈉溶液）；但在飛機上發(fā)生溢出時，則應該使用季銨鹽類消毒劑，如苯扎溴銨等。

4、使用消毒劑時，從溢出區(qū)域的外圍開始，向中心進行處理。

5、作用適當時間后（例如30 分鐘），將所處理物質(zhì)清理掉。如果含有碎玻璃或其他銳器，則要使用簸箕或硬的厚紙板來收集處理過的物品，并將它們置于可防刺透的容器中以待處理。

6、對溢出區(qū)域再次清潔并消毒（如有必要，重復第2～5步）。

7、將污染材料置于防漏、防穿透的廢棄物處理容器中。

8、在成功消毒后，通知主管部門目前溢出區(qū)域的清除污染工作已經(jīng)完成。

（二）菌（毒）外溢在防護服上

此時應立即進行局部消毒和更換。被污染的防護服要用消毒液浸泡后再進行高壓滅菌處理。

（三）菌（毒）外溢到皮膚粘膜

在實驗中發(fā)生菌（毒）外溢到皮膚粘膜的事故時，被視為有很大的危險存在，應立即停止工作，能用消毒液的部位可進行消毒，然后用水沖洗15～20min ，，處理后方能安全撤離。并視情況隔離觀察，在此期間應當根據(jù)條件進行適當?shù)念A防治療。

（四）皮膚刺傷

若發(fā)生皮膚被刺破時應被視為有極大危險，應立即停止工作，并對傷口進行擠血，用水沖洗消毒。并視情況隔離觀察，其間根據(jù)條件進行適當?shù)念A防治療。

（五）離心管發(fā)生破裂

1、非封閉離心桶的離心機內(nèi)盛有潛在感染性物質(zhì)的離心管發(fā)生破裂： ①如果機器正在運行時發(fā)生破裂或懷疑發(fā)生破裂，應關(guān)閉機器電源，停止后密閉離心筒至少30min ，使氣溶膠沉積。

②如果機器停止后發(fā)現(xiàn)破裂，應立即將蓋子蓋上，并密閉至少30min 。發(fā)生這兩種情況時都應報告實驗室負責人。

③所有操作都應加強個人呼吸保護并戴結(jié)實的手套（如厚橡膠手套），必要時可在外面戴適當?shù)囊淮涡允痔住?/span>

④當清理玻璃碎片時應當使用鑷子，或用鑷子夾著的棉花來進行。所有破碎的離心管、玻璃碎片、離心桶、十字軸和轉(zhuǎn)子都應放在無腐蝕性的、已知對相關(guān)微生物具有殺滅活性的消毒劑內(nèi)。未破損的帶蓋離心管應放在另一個有消毒劑的容器中，然后回收。離心機內(nèi)腔應用適當濃度的同種消毒劑反復擦拭，然后用水沖洗并干燥。清理時所使用的全部材料都應按感染性廢棄物處理。

2、在可封閉的離心桶（安全杯）內(nèi)離心管發(fā)生破裂

所有密封離心桶都應在生物安全柜內(nèi)裝卸。如果懷疑在安全杯內(nèi)發(fā)生破損，應該松開安全杯蓋子并將離心桶高壓滅菌。還可以采用化學方法消毒安全杯。

參考文獻： Laboratory Biosafety Manual （WHO—第3版）

（感謝王老師的科學研究，致敬！）

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