大規(guī)模培養(yǎng)常用方法（貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)與固定化培養(yǎng)）

根據(jù)動物細胞的類型，可采用貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)等三種培養(yǎng)方法進行大規(guī)模培養(yǎng)。

一、動物細胞生長特性及培養(yǎng)溫度

1. 細胞生長緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素
2.細胞大，無細胞壁，機械強度低，環(huán)境適應性差
3.需氧少，不耐受強力通風與攪拌
4. 群體生長效應，貼壁生長（錨地依賴性）
5.培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細胞內外，成本高
6.原代培養(yǎng)細胞一般繁殖50代即退化死亡

依據(jù)在體外培養(yǎng)時對生長基質依賴性差異，動物細胞可分為兩類：

●貼壁依賴型細胞：需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面才能生長，大多數(shù)動物細胞，包括非淋巴組織細胞和許多異倍體細胞均屬于這一類。

●非貼壁依賴型細胞：無需附著于固相表面即可生長，包括血液、淋巴組織細胞、許多腫瘤細胞及某些轉化細胞。
培養(yǎng)細胞的最適溫度相當于各種細胞或組織取材機體的正常溫度。人和哺乳動物細胞培養(yǎng)的最適溫度為 35~37℃。偏離這一溫度，細胞正常的代謝和生長將會受到影響，甚至死亡?？偟膩碚f，培養(yǎng)細胞對低溫的耐力比高溫高。溫度不超過39℃時，細胞代謝強度與溫度成正比；細胞培養(yǎng)置于39~40℃環(huán)境中1h，即受到一定損傷，但仍能恢復；當溫度達43℃以上時，許多細胞將死亡。當溫度下降到30~20℃時，細胞代謝降低，因而與培養(yǎng)基之間物質交換減少。首先看到的是細胞形態(tài)學的改變以及細胞從基質上脫落下來。當培養(yǎng)物恢復到初始的培養(yǎng)溫度時，它們原有的形態(tài)和代謝也隨之恢復到原有水平。

二、貼壁培養(yǎng)（attachment culture）是指細胞貼附在一定的固相表面進行的培養(yǎng)。

1. 生長特性：貼壁依賴型細胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進入對數(shù)生長期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細胞單層。

2.貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點：
●容易更換培養(yǎng)液；細胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。
●容易采用灌注培養(yǎng)，從而達到提高細胞密度的目的；因細胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。
●當細胞貼壁于生長基質時，很多細胞將更有效的表達一種產(chǎn)品。
●同一設備可采用不同的培養(yǎng)液/細胞的比例。
●適用于所有類型細胞。

3. 貼壁培養(yǎng)的缺點：與懸浮培養(yǎng)法相比
●擴大培養(yǎng)比較困難，投資大；
●占地面積大；
●不能有效監(jiān)測細胞的生長；

4.細胞貼壁的表面：要求具有凈陽電荷和高度表面活性。對微載體而言還要求具一定電荷密度；若為有機物表面，必須具有親水性，并帶陽電荷。

5. 貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)：主要有轉瓶、中空纖維（后面專題介紹）、玻璃珠、微載體系統(tǒng)（后面介紹）等。

●轉瓶培養(yǎng)系統(tǒng)：培養(yǎng)貼壁依賴型細胞最初采用轉瓶系統(tǒng)培養(yǎng)。轉瓶培養(yǎng)一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段，或作為生物反應器接種細胞準備的一條途徑。細胞接種在旋轉的圓筒形培養(yǎng)器-轉瓶中，培養(yǎng)過程中轉瓶不斷旋轉，使細胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣，從而提供較好的傳質和傳熱條件。

轉瓶培養(yǎng)具有結構簡單，投資少，技術成熟，重復性好，放大只需簡單的增加轉瓶數(shù)量等優(yōu)點。

但也有其缺點：勞動強度大，占地空間大，單位體積提供細胞生長的表面積小，細胞生長密度低，培養(yǎng)時監(jiān)測和控制環(huán)境條件受到限制等。

現(xiàn)在使用的轉瓶培養(yǎng)系統(tǒng)包括二氧化碳培養(yǎng)箱和轉瓶機兩類。

●反應器貼壁培養(yǎng) 此種培養(yǎng)方式中，細胞貼附于固定的表面生長，不因為攪拌而跟隨培養(yǎng)液一起流動，因此比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離細胞和培養(yǎng)液的設備，可以采用灌流培養(yǎng)獲得高細胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品；但擴大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細胞的生長情況，故多用于制備用量較小、價值高的生物藥品。

大規(guī)模培養(yǎng)常用方法（貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)與固定化培養(yǎng)）

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