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免疫印跡（Western blot）檢測科研實驗技術(shù)服務(wù)介紹
閱讀：25 發(fā)布時間：2024-9-24
應(yīng)用簡介
蛋白質(zhì)免疫印跡法(WesternBlot)，簡稱WB，是指通過SDS-PAGE膠將不同分子量的蛋白質(zhì)分離開，然后將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移到載體(PVDF)膜上，利用抗原抗體的特異性結(jié)合，用特異性的一抗結(jié)合目標(biāo)蛋白，用HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合一抗，再加以ECL發(fā)光液顯色，檢測組織或者細(xì)胞內(nèi)某種或者某些特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)。蛋白質(zhì)免疫印跡是做蛋白質(zhì)分析的一種常規(guī)技術(shù)，常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進(jìn)行定性和半定量分析，還可以用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA相互作用后續(xù)分析。WB技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個研究領(lǐng)域。
技術(shù)原理
通過SDS-PAGE凝膠將細(xì)胞或生物樣品內(nèi)的蛋白按照蛋白分子量從大到小規(guī)律分離開。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜或PVDF膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)（目前主要用HRP標(biāo)記的第二抗體），經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分（目前主要使用魯米諾和二抗中的HRP反應(yīng)發(fā)出熒光，通過儀器或者膠片顯色）。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。
實驗方法
常見問題
1、WB有什么優(yōu)點？
靈敏，可達(dá)ng級，用ECL顯色法可達(dá)pg級。靈敏，相對便宜且特異性高。
2、細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？
有沉淀可能因為蛋白沒有變性wan全，可以適當(dāng)提高SDS的濃度，同時將樣品煮沸時間延長，一般需96℃以上10-15min左右；也不排除抗原濃度過高，這時需再加入適量上樣緩沖液。
3、膠片背景很臟，有什么解決方法？
減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛?，改變一抗孵育時間和溫度(盡量4℃過夜，此孵育條件比37℃1h要溫和很多)，并提高封閉液濃度。
4、目標(biāo)帶是空白，周圍有背景，是為什么？
一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP催化活力太強(qiáng)，同時顯色底物處于一個臨界點，反應(yīng)時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象"。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，或更換新進(jìn)口的顯色底物。
5、電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象：
①“︶"條帶呈笑臉狀
原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好；電泳系統(tǒng)溫度偏高，而且電場強(qiáng)度太大(電泳的電場大致呈現(xiàn)U形，所以因為趕時間而加大電壓可能會出現(xiàn)這個)。
②“︵"條帶呈皺眉狀
原因：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不wan全。
③條帶拖尾
原因：樣品溶解不好，或存在一定程度地蛋白降解。
④紋理(縱向條紋)
原因：樣品中含有不溶性顆粒，可能抽提蛋白時出了問題。
⑤條帶偏斜
原因：電極不平衡或者加樣位置偏斜，一定要子平面臺子上電泳，膠要做好。
⑥條帶兩邊擴(kuò)散
原因：加樣量過多，彌散至孔周圍了，減少上樣量或者使用5X上樣緩沖液。