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細(xì)胞復(fù)蘇的主要步驟及注意事項(xiàng)
閱讀:160 發(fā)布時間:2024-11-5一、主要步驟:
①將冷凍管從液氮中取出,迅速投入37℃水浴融化,細(xì)胞融化后要盡快(約1min)移出37℃水浴。37℃水浴時間延長會提高細(xì)胞死亡率,復(fù)蘇過程中一般細(xì)胞死亡率在20%~25%之間。
②迅速用酒精棉球擦拭冷凍管外部殺菌消毒,然后放置在冰浴上。
③小心開啟瓶蓋,把細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有4mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,然后把培養(yǎng)瓶移至培養(yǎng)箱,36℃~38℃培養(yǎng)1h,讓細(xì)胞貼壁。
④細(xì)胞貼壁后,小心移棄培養(yǎng)基,主要是去掉DMSO(懸浮生長細(xì)胞要通過離心沉淀除去DMSO)、死細(xì)胞及其碎片,加5mL新鮮培養(yǎng)基,36℃~38℃培養(yǎng)。
⑤細(xì)胞培養(yǎng)24h后,更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)直到形成單層,便可以傳代。
⑥詳細(xì)記錄復(fù)蘇細(xì)胞的名稱、數(shù)量、復(fù)蘇時間、存放部位等。
二、注意事項(xiàng):
1、注意無菌操作。
2、應(yīng)在1-2min內(nèi)使凍存液融化。如果復(fù)溫速度太慢,則會造成細(xì)胞損傷。另外,細(xì)胞復(fù)蘇后的操作最好在4℃冰浴中進(jìn)行,以減少冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞的毒性。
3、細(xì)胞復(fù)蘇過程中,升溫的速率要大,把從液氮或-70℃冰箱中取出的細(xì)胞在最短的時間內(nèi)放入水浴鍋。
4、細(xì)胞放入水浴中注意用鑷子夾住細(xì)胞凍存管并在水浴中不時晃動,使其受熱均勻,并防止水浴時水進(jìn)入細(xì)胞凍存管污染細(xì)胞。打開細(xì)胞凍存管之前要用酒精棉球?qū)龃婀芟静⒘栏伞?br style="box-sizing: border-box; margin: 0px; padding: 0px;"/>5、液氮操作有一定的危險性,打開液氮罐取出細(xì)胞時,戴上防護(hù)眼鏡。