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PCR 成功的四大要素及注意事項
閱讀：651 發(fā)布時間：2023-10-8一、模板
1. 模板降解
1）盡量選擇新鮮提取的模板進行 PCR 擴增，通過凝膠電泳檢測模板的完整性，若降解嚴重需要重新制備模板；
2）模板避免反復凍融。
2. 模板中含有抑制 DNA 聚合酶活性的抑制劑
1）采用離心柱法提取核酸，純化模板，消除抑制劑的干擾；
2）適當減少模板量，采用梯度稀釋摸索最佳模板量；
3）選用抗逆性強的 DNA 聚合酶。
3. 模板量太低
1）適當增加模板量；
2）模板為 cDNA 時，選用目的基因表達量高的組織提取高質量 RNA 并選用基因克隆專用的反轉錄試劑盒得到的 cDNA 作為模板；
3）選用靈敏度高的 DNA 聚合酶。
4. 高 GC, 復雜模板
1）使用 PCR 添加劑（比如 DMSO，甜菜堿）或 GC enhancer，促進高 GC，復雜序列模板雙鏈解離從而有利于引物退火和序列延伸；
2）增加變性時間或溫度，使 DNA 雙鏈解離；
3）選用適用于高 GC，復雜模板擴增的 DNA 聚合酶。
5. 長片段
1）確保模板的完整性；
2）選擇適用于長片段擴增的 Taq DNA 聚合酶或者高保真 DNA 聚合酶；
3）在試劑盒說明書建議的延伸速度基礎上適當延長延伸時間；
4）采用抑制熱交錯 PCR（Suppression Thermo-Interlaced PCR, STI PCR）策略。
二、引物
1. 引物降解
1）重新合成高質量引物，少量分裝保存，防止多次凍融，避免長期置于冰箱冷藏部分。
2. 引物設計不合理
1）建議使用引物設計軟件（比如 Primer premier 6, Oligo 7 等）設計并選取評分較高的引物；
2）確保引物和模板結合的特異性。
三、DNA 聚合酶及其他反應組分
1. DNA 聚合酶選擇不合適
1）根據(jù)實驗目的選擇合適的 DNA 聚合酶，比如分子克隆實驗中涉及到序列的高保真擴增，需要選擇一款針對不同類型序列具有普適性的高保真酶。
2. DNA 聚合酶活力下降
1）檢查試劑是否過期，按照說明書要求合理保存試劑。
3. 反應緩沖液體系與目的基因不匹配
1）不同目的 PCR 反應要求反應緩沖液中的鎂離子、鉀離子、銨離子、化學添加劑等成分濃度是不一樣的，建議使用試劑盒中優(yōu)化好的緩沖液體系。
四、反應條件
1. 退火溫度不合適，影響引物與模板特異結合
1）使用引物設計軟件建議的退火溫度，退火溫度一般比引物的 Tm 值低 5 ℃；
2）不同的試劑鹽離子濃度不同，最佳的退火溫度可能存在差異，建議以軟件建議退火溫度為中心設置溫度梯度，來獲得最佳退火溫度；
3）設置降落 PCR（Step-down）反應程序。
2. 其他反應條件不合適
1）不同的 DNA 聚合酶試劑最佳反應條件是有差別的，選用試劑說明書建議的變性溫度和時間，退火時間，延伸溫度和速度，循環(huán)數(shù)。