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重組蛋白溶解復(fù)溶緩沖液和載體蛋白
閱讀：545 發(fā)布時間：2023-5-16干粉形式的重組蛋白在常溫下能夠保持穩(wěn)定，大多數(shù) MCE 重組蛋白以干粉形式發(fā)貨。凍干粉在使用前需進(jìn)行溶解，這時候會常看到一位陌生又熟悉的“朋友"——載體蛋白。
溶解教學(xué)：
Step 1: 判斷實驗周期。短期實驗<=7 天，溶解材料：復(fù)溶緩沖液；長期實驗>=7 天，溶解材料：復(fù)溶緩沖液、載體蛋白。
Step 2: 開蓋前離心。凍干粉在運輸過程中，會因為外力因素粘附于管壁或者管蓋上，在開蓋之前，先通過離心操作，將凍干粉收集于管底，避免損失和浪費。建議 10,000-12,000 rpm 高速離心 30 s；若沒有高速離心機，3,000-3,500 rpm 離心 5 min。
Step 3: 短期實驗：向凍干粉中加入提供的復(fù)溶緩沖液，用槍頭輕輕吹打混勻，重懸至濃度不低于 100 μg/mL。分裝每管不少于 20 μL.
長期實驗：先用復(fù)溶緩沖液將蛋白溶解，再用含載體蛋白 (0.1% BSA，5% HSA，10% FBS，或 5% 海藻糖) 的溶液進(jìn)一步稀釋，濃度不低于 100 μg/mL，然后分裝凍存于 -20°C 至 -80°C。
為什么重組蛋白要凍干？
蛋白質(zhì)對熱非常敏感，蛋白質(zhì)凍干可以使蛋白質(zhì)的大部分活性得以保留，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，延長儲存時間，同時降低運輸成本。但凍干可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)喪失部分活性、聚集和其他退化問題，需通過添加保護(hù)劑(穩(wěn)定劑、添加劑、賦形劑) 和控制各種凍干條件以盡可能減少負(fù)面影響。MCE 大部分重組蛋白以凍干粉的形式提供，室溫下非常穩(wěn)定，支持常溫運輸，為確保蛋白質(zhì) 100% 的活性，我們通常以冰袋運輸，建議收到產(chǎn)品后 -20℃ 或 -80 ℃ 保存。
我應(yīng)該如何儲存重組蛋白？
對于長期儲存，蛋白質(zhì)溶液應(yīng)與載體蛋白 (例如 0.1% BSA、10% FBS、5% HSA 和 5% 海藻糖) 分裝保存，并在 -20°C 至 -80°C 下冷凍保存。在分裝凍存前，建議用含載體蛋白的溶液進(jìn)一步稀釋 (濃度不低于 100 μg/mL)。保存產(chǎn)品時請避免反復(fù)凍融，每個冷凍-解凍循環(huán)都可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和降解。
載體蛋白使蛋白保存更穩(wěn)定的原理是什么？
塑料管壁對蛋白有很強的吸附作用，會導(dǎo)致重組蛋白粘附在管壁不易分離，進(jìn)而導(dǎo)致溶液中重組蛋白的實際濃度偏低，最終導(dǎo)致其活性下降。在復(fù)溶重組蛋白時，加入載體蛋可以預(yù)先封閉塑料管壁上蛋白結(jié)合位點，避免重組蛋白粘附于管壁。此外，載體蛋白也能維持蛋白在低溫條件下的穩(wěn)定，使其保持活性。如果在重組蛋白凍干粉復(fù)溶后，不用含載體蛋白的溶液進(jìn)一步稀釋，而是直接分裝凍存，則溶液中的大部分重組蛋白均會粘附到管壁上，導(dǎo)致溶液中實際溶解的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度大大降低，最終表現(xiàn)為重組蛋白活性的下降。
含載體蛋白的溶液指的是什么溶液呢？水可以嗎？
為了維持一定的 pH 值跟鹽類濃度，避免蛋白不穩(wěn)定，不建議用水，該溶液通常建議選擇 pH 近中性、有一定緩沖能力的緩沖液，如PBS、培養(yǎng)基 (RPMI1640, DMEM 等) 等。
海藻糖 or BSA 怎么選？
一般情況下，用于細(xì)胞或組織培養(yǎng)可以使用含有 BSA 載體的重組蛋白。但是，當(dāng)進(jìn)行某些實驗，如體內(nèi)實驗、蛋白標(biāo)記時，BSA 可能會干擾實驗，則不適合使用添加 BSA 的重組蛋白。另外，如果實驗平臺有特殊要求，也應(yīng)根據(jù)要求選擇不含 BSA 的蛋白。做無血清培養(yǎng)或動物的體內(nèi)實驗時，細(xì)胞因子中不能含有 BSA，F(xiàn)BS 或 HSA 等動物或人的蛋白，建議選擇5% 海藻糖作為載體蛋白。