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影響PCR反應(yīng)的五大要素
閱讀:1263 發(fā)布時(shí)間:2022-9-30影響 PCR 反應(yīng)的五要素:
1、引物
引物是 PCR 特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板 DNA 互補(bǔ)的程度。理論上,只要知道任何一段模板 DNA 序列,就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用 PCR 就可將模板 DNA 在體外大量擴(kuò)增。
設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則:
①引物長度: 15-30bp,常用為 20bp 左右。
②引物擴(kuò)增跨度: 以 200-500bp 為宜,特定條件下可擴(kuò)增長至 10kb 的片段。
③引物堿基:G+C 含量以 40-60% 為宜,G+C 太少擴(kuò)增效果不佳,G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC 蕞 hao 隨機(jī)分布,避免 5 個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是 3'端的互補(bǔ),否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物 3'端的堿基,特別是蕞末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致 PCR 失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn),被擴(kuò)增的靶序列最 hao 有適宜的酶切位點(diǎn),這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量:每條引物的濃度 0.1~1umol 或 10~100pmol,以蕞低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。
2、酶
目前有兩種 Taq DNA 聚合酶供應(yīng), 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反應(yīng)約需酶量 2.5U(指總反應(yīng)體積為 100ul 時(shí)),濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
3、dNTP
dNTP 的質(zhì)量與濃度和 PCR 擴(kuò)增效率有密切關(guān)系,dNTP 粉呈顆粒狀,如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP 溶液呈酸性,使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后,以 1M NaOH 或 1M Tris。HCL 的緩沖液將其 PH 調(diào)節(jié)到 7.0~7.5,小量分裝, -20℃ 冰凍保存。多次凍融會使 dNTP 降解。
在 PCR 反應(yīng)中,dNTP 應(yīng)為 50~200umol/L,尤其是注意 4 種 dNTP 的濃度要相等 ( 等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí) (偏高或偏低),就會引起錯(cuò)配。濃度過低又會降低 PCR 產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP 能與 Mg2+結(jié)合,使游離的 Mg2+濃度降低。
4、模板
模板核酸的量與純化程度,是 PCR 成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,傳統(tǒng)的 DNA 純化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 來消化處理標(biāo)本。SDS 的主要功能是:溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜,并解離細(xì)胞中的核蛋白,SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀;蛋白酶 K 能水解消化蛋白質(zhì),特別是與 DNA 結(jié)合的組蛋白,再用有機(jī)溶劑酚與 lv 仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于 PCR 反應(yīng)。
一般臨床檢測標(biāo)本,可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,直接用于 PCR 擴(kuò)增。RNA 模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶 K 法,要防止 RNase 降解 RNA。
5、Mg2+濃度
Mg2+對 PCR 擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,在一般的 PCR 反應(yīng)中,各種 dNTP 濃度為 200umol/L 時(shí),Mg2+濃度為 1.5~2.0 mmol/L 為宜。Mg2+濃度過高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,濃度過低會降低 Taq DNA 聚合酶的活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少。