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熒光假單胞菌探針發(fā)熒光定量PCR試劑盒說明書
閱讀：212 發(fā)布時間：2024-6-4| 提 供 商 | 上海研生實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 12.9KB |
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熒光假單胞菌探針發(fā)熒光定量PCR試劑盒說明書
產(chǎn)品及特點熒光假單胞菌是一種環(huán)境污染菌。對于人類是一種罕見的機會致病菌?？蓮膫?、痰、胸水、尿和血液中分離出來，也可從血庫存在中分離出。可在冰箱儲存的血液及血液制品中繁殖，而且自溶后釋放內(nèi)毒素。其內(nèi)毒素的磷脂部分，可導致輸血后不可逆的休克。因此快速靈敏檢測熒光假單胞菌具有重要意義。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒，它具有下列特點：
1.即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。
2.引物經(jīng)過精心優(yōu)化，專一性強，只擴增熒光假單胞菌，與其他微生物沒有交叉反應。
3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4.PCR mix 中含上樣染料，PCR 后可以直接上樣電泳。
1.本試劑盒足夠做 40μL 體系的 PCR 50 次，但只能用于科研。
熒光假單胞菌探針發(fā)熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分成分 包裝
2×Probe qPCR MagicMix500μL ）
熒光 PCR 專用模板稀釋液1mL
熒光假單胞菌探針法 qPCR
引物-探針混合液150μL ）
熒光假單胞菌探針法 qPCR 陽性
對照(1×10E7 拷貝/μL)50μL
使用手冊1 份
運輸及保存低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
自備試劑樣品 DNA。
使用方法一、稀釋PCR 陽性對照（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）
如果做定性實驗，則此步可以跳過。如果做定量實驗，則需要稀釋陽性對照做標準曲線。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照， 只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1.標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。
2.用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。
3.在 6 號管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照（試劑盒提供），充分震蕩 1 分鐘，
得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在 5 號管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭，在 4 號管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照（上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。二、樣品 DNA 的制備
7.如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是樣品制備 PC（樣品制備陽性對照），一個是樣品制備 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為樣品制備 PC。另外用水作為樣品制備 NC。
8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。三、Probe qPCR 反應熒光假單胞菌探針發(fā)熒光定量PCR試劑盒（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9.如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管中的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為描述操作步驟，
10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
11.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR：
過程溫度時間
預變性95℃2min
qPCR 反應
（40 個循環(huán)）95℃15sec
55℃30sec（采集 FAM 通道的熒光信號）
72℃30sec
四、熒光假單胞菌探針發(fā)熒光定量PCR試劑盒數(shù)據(jù)處理
12.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品， 如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，
則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
產(chǎn)品CAT#:BH5216-51
低溫運輸，-20℃保存