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預(yù)染蛋白marker常見問題及解決方法
閱讀：463 發(fā)布時間：2023-2-8Q1:我
*查使用的凝膠類型/凝膠百分比?？赡軙捎谀z類型和/或百分比的不同而不能看到所有條帶。例如，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的最小條帶可能不能在非常低百分比的凝膠上分辨，而較高分子量條帶可能不能在高百分比凝膠上分辨。
*檢查蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品的有效日期。由于蛋白質(zhì)降解，過期批次可能導(dǎo)致條帶褪色或缺失。
*檢查蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品的儲存條件。不適當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件會損害標(biāo)準(zhǔn)品中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。
*確保蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品在上樣到凝膠上之前未加熱/煮沸。我們的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品可直接上樣，我們不建議將其加熱/煮沸，因為這可能會導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)品中的蛋白質(zhì)降解。
*上樣時，請注意確保相鄰樣品泳道沒有交叉污染。
*確保每個泳道上標(biāo)準(zhǔn)品的量都是正確的。蛋白質(zhì)上樣過多會導(dǎo)致產(chǎn)生額外的條帶，這個問題在使用銀染凝膠時尤為突出。
*標(biāo)準(zhǔn)品儲存不當(dāng)或反復(fù)凍融會導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解。
*降低電壓、電流或縮短轉(zhuǎn)印時間
*確保轉(zhuǎn)膜緩沖液的甲醇濃度合適；可使用濃度為10–20%的甲醇，從而去除SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物中的SDS，并促進(jìn)蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合。
*確保轉(zhuǎn)膜緩沖液的SDS濃度合適（若加入了SDS），SDS濃度不要超過0.02–0.04%。過多的SDS會阻礙蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合。
*檢查膜的孔徑和靶標(biāo)蛋白質(zhì)的大小。小于10kDa的蛋白質(zhì)很容易穿過0.45μm孔徑的膜。如果您的目標(biāo)蛋白質(zhì)小于10 kDa，那么最好使用0.2μm孔徑的膜。
*增加電壓、電流或轉(zhuǎn)印時間
*凝膠和SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物中的SDS會促進(jìn)蛋白質(zhì)從凝膠中洗脫，但抑制蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合。這種抑制作用在硝化纖維素膜上的強(qiáng)度大于PVDF膜。對于難以從凝膠中洗脫的蛋白質(zhì)，如大分子量蛋白質(zhì)，可在轉(zhuǎn)膜緩沖液中加入少量SDS以改善轉(zhuǎn)印效果。我們建議在組裝三明治前將凝膠置于含0.02–0.04% SDS的2x轉(zhuǎn)膜緩沖液（無甲醇）中預(yù)平衡10分鐘，然后使用含10%甲醇和0.01% SDS的1X轉(zhuǎn)膜緩沖液進(jìn)行轉(zhuǎn)印。
*甲醇可去除SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物中的SDS，促進(jìn)蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合，但對凝膠本身有一些不良影響，會降低轉(zhuǎn)印效率。甲醇可能導(dǎo)致孔徑減小、某些蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀以及一些堿性蛋白質(zhì)帶正電荷或變?yōu)橹行?。?yīng)確保轉(zhuǎn)膜緩沖液的甲醇濃度不高于10–20%，并使用高質(zhì)量的分析級甲醇。
*確保每個泳道上標(biāo)準(zhǔn)品的量都是正確的。蛋白質(zhì)上樣過多會導(dǎo)致模糊，這個問題在使用銀染凝膠時尤為突出。
*條帶在低百分比凝膠中不能很好地分辨。嘗試使用更高百分比的凝膠。
*如果在轉(zhuǎn)膜/檢測后條帶看起來不明顯和模糊，可能是由于抗體濃度過高。遵循制造商建議的稀釋度或通過斑點(diǎn)印跡確定最適抗體濃度。
*凝膠上的分子量標(biāo)準(zhǔn)品的量不足： 將適當(dāng)體積的分子量標(biāo)準(zhǔn)品上樣到凝膠上。以下是我們的建議：(小型凝膠：每孔5μL（厚度0.75-1.0 mm）或每孔10μL（厚度1.5 mm）;•大凝膠：每孔10μL（厚度0.75-1.0 mm）或每孔20μL（厚度1.5 mm）)
*轉(zhuǎn)印不全或不理想： 優(yōu)化轉(zhuǎn)印條件
*樣品被煮沸： 丟棄煮沸的分裝樣品。
*使用的分子量標(biāo)準(zhǔn)品體積過大： 加入較少的體積或使用前用蛋白質(zhì)上樣緩沖液稀釋分子量標(biāo)準(zhǔn)品。